Un método simple y eficiente para probar agentes inmunomoduladores para la generación de células dendríticas tolerogénicas a partir de monocitos CD14⁺ humanos

Buscamos comprender qué tratamientos inmunomoduladores pueden generar células dendríticas toleradas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos ya diferenciadas, y esto es muy valioso para la investigación autoinmune y de trasplantes. Las autoterapias se están volviendo más prácticas debido a los avances en la fabricación y las células dendríticas tolerogénicas se han mostrado prometedoras en estudios preclínicos. Pueden generar tolerancia específica al antígeno. La más común es para citometría. Esto proporciona una forma rápida y también accesible de analizar las células toleradas. Es un desafío generar células dendríticas tolerogénicas que persistan en ambas funciones in vivo. Es por eso que no existen terapias con células dendríticas clínicamente aprobadas para tolerar. Hemos identificado combinaciones novedosas de compuestos inmunomoduladores a partir de grandes estudios de cribado que muestran una mejora en la funcionalidad de las células dendríticas toleradas. También diseñamos formulaciones de nanopartículas tolerantes.

[Instructor] Para comenzar, coloque los tubos de 15 mililitros que contienen monocitos humanos enriquecidos y con células T en una centrífuga. Una vez completada la centrifugación, use una pipeta para aspirar el sobrenadante de los tubos. Agregue un mililitro de medio de cultivo MODC al gránulo de monocitos, un mililitro de medio de cultivo de células T al tubo con las células T y mezcle bien antes del recuento de células. A continuación, agregue nueve mililitros de medio de cultivo MODC tibio a la suspensión de monocitos para obtener el volumen final de 10 mililitros. A continuación, pipetee 100 microlitros de soluciones madre GM-CSF e IL-4. Transfiera la suspensión a una placa de Petri etiquetada, marcada como MODC, e incube. Luego, agregue un mililitro de medio de congelación de células T a la suspensión de células T. Divida la mezcla en dos viales criogénicos de dos mililitros. Coloque los viales criogénicos sellados en una cámara de congelación con tubos de equilibrio en pocillos no utilizados. El cuarto día, agregue cinco mililitros de medio de cultivo MODC fresco al tubo de monocitos. A continuación, pipetee 100 microlitros de cada una de las soluciones madre de GM-CSF e IL-4 siete e incube hasta el día siete. El séptimo día, transfiera las células dendríticas derivadas de monocitos diferenciados, o MDOC, a un tubo de 50 mililitros y centrifugue como antes. Agregue un mililitro de medio de cultivo MODC tibio al gránulo celular y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Cuente las células con un hemocitómetro. Diluir la suspensión con medio de cultivo MODC tibio que contenga GM-CSF e IL4 hasta obtener la concentración celular deseada. Dispense 100 microlitros de la suspensión que contiene 30,000 células en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano. Agregue un microlitro de medicamentos inmunomoduladores en los pocillos designados e incube. Al día siguiente, centrifugar la placa MODC a 300 G durante cinco minutos. Después de quitar suavemente el sobrenadante, agregue suavemente 200 microlitros de HBSS tibio al costado de la placa y centrifuge. Nuevamente, agregue 100 microlitros de medio de cultivo MODC tibio que contenga GM-CSF e IL4 después de la aspiración con sobrenadante. Si se usa inmunoestimulación, agregue un microlitro de 100 veces más existencias de lipopolisacárido a los pocillos designados e incube. El octavo día, descongele dos viales criogénicos en un baño de perlas calientes a 37 grados centígrados hasta que el contenido comience a derretirse. Una vez parcialmente descongelados, transfiera los viales a una campana de cultivo celular. Luego agregue un mililitro de medio de cultivo de células T tibio para descongelar rápidamente las células. Transfiera el contenido a un tubo de 50 mililitros y enjuague los viales criogénicos con un mililitro adicional de medio de cultivo de células T para recolectar todas las células. Rellene la suspensión con una solución de tinción de flujo a 15 mililitros y centrifugue. Vuelva a suspender el sedimento en cinco mililitros de solución de tinción de flujo y centrifugar nuevamente, luego vuelva a suspender el sedimento celular en un mililitro de medio de cultivo de células T tibio después de pipetear el sobrenadante. Agregue nueve mililitros de medio de cultivo de células T tibio para obtener un volumen final de 10 mililitros. Transfiera la suspensión a una placa de Petri etiquetada como células T redescongeladas e incube. El octavo día, centrifugar la placa MODC a 300 G durante cinco minutos. Después de pipetear el sobrenadante, agregue 200 microlitros de solución de tinción de flujo a cada pocillo e incube. A continuación, pipetee hacia arriba y hacia abajo para extraer las células adheridas y la suspensión celular a una nueva placa de fondo en V de 96 pocillos antes de volver a centrifugar. Pipetee 50 microlitros de anticuerpo inhibidor de la unión al receptor de FC en cada pocillo después de aspirar el sobrenadante para bloquear la unión inespecífica. Después de incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos, agregue 50 microlitros del cóctel de anticuerpos del panel de validación preparado en cada pocillo. Mezclar 50 microlitros de perlas de compensación con 50 microlitros de cada anticuerpo diluido en tubos de 1,5 mililitros e incubar. Centrifugar la placa a 300 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el gránulo en 200 microlitros de solución de tinción de flujo para lavar las células. Después del lavado final y la centrifugación, vuelva a suspender las células en 110 microlitros de solución de tinción de flujo para el análisis de citometría de flujo. Para los MODC tolerogénicos, sustituya el cóctel de anticuerpos por el cóctel del panel de tolerancia. El día nueve, transfiera la placa de Petri de células T descongelada a un tubo de 50 mililitros y rellene el tubo con una solución de tinción de flujo. Utilice el segundo tubo que contiene células T sin teñir para el análisis trigonométrico. Gira los tubos a 250 g durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en medios de cultivo celular calientes. Cuente las células T y asegúrese de obtener un mínimo de 4 millones de células. Centrifugar la placa MODC a 300 G durante cinco minutos. Después de aspirar los sobrenadantes, agregue 200 microlitros de células T en cada pocillo. Agregue células T sin teñir para placas de análisis trigonométrico. Agregue 25 microlitros por mililitro de cóctel de anticuerpos anti-CD3 / CD28 a todos los grupos, excepto a los pocillos de control negativo, para estimular las células T e incubar hasta el día 12. A continuación, transfiera todas las suspensiones celulares de la placa de cultivo de 96 pocillos a una placa de fondo en V con solución de tinción de flujo. Lave las células dos veces en 200 microlitros de solución de tinción de flujo. Reserve algunas celdas para los controles de compensación. Después del segundo lavado, centrifugar la placa. Luego agregue 50 microlitros de anticuerpo inhibidor de unión al receptor de FC diluido en cada pocillo e incube. Cuando se complete la incubación, agregue 50 microlitros del cóctel de anticuerpos del panel trigonométrico preparado en cada pocillo. Para los controles de compensación, mezcle 50 microlitros de células de compensación sin teñir con 50 microlitros de cada anticuerpo teñido individual. Incube la placa y los controles de compensación a cuatro grados centígrados durante una hora, luego lave con una solución de tinción de flujo antes de centrifugar. Ahora tiña las células con colorante de infrarrojo cercano vivo/muerto diluido en HBSS a 200 microlitros por pocillo antes de la incubación en frío. Lave y centrifugue la placa antes de teñirla con Fox P3 y análisis de citometría de flujo. En el primer día, los monocitos indiferenciados eran predominantemente HLA-DR-menos con un pequeño CD14 menos, mientras que los monocitos diferenciados en el séptimo día mostraron la mayoría de las células como HLA-DR-más CD14 menos, CD1c-plus, CD141 más. El tratamiento con rapamicina con y sin lipopolisacárido, redujo significativamente las poblaciones de DC-SIGN-plus CD1c-plus e inhibió la regulación positiva de los marcadores CD86 y CD40 observados con el tratamiento con LPS solo. Las poblaciones de células reguladoras T P3-plus de FOX aumentaron cuando los MDC se cocultivaron con células T. Pero no se observaron diferencias significativas entre los cuatro grupos de tratamiento de MODC. La proliferación de células T se redujo en las poblaciones de células T CD4-plus y CD8-plus después del cocultivo con MDOC tratados con Rapa. Las muestras tratadas con interleucina-10 aumentaron significativamente la producción de interleucina-10 a las 24 horas. Los MDOC tratados con dex aumentaron significativamente la producción de interleucina-10, pero solo después de descansar durante 72 horas. El pretratamiento con dexametasona redujo la generación media de TNF alfa tras el tratamiento con LPS a las 24 horas. Se observaron aumentos significativos en los MDOC PDL1-plus en los grupos tratados con Dex plus LPS y Rapa a las 72 horas. Se observó supresión de la expresión de CD86 en todos los grupos tratados con inmunomoduladores tanto a las 24 como a las 72 horas. Los MDOC tratados con inmunomoduladores no aumentaron la proliferación de células T CD4-plus.