Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

La preparación de células dendríticas a partir de la médula ósea proporciona una excelente fuente de células presentadoras de antígenos que se pueden utilizar para experimentos in vitro o in vivo en dos partes del sistema inmunitario. La introducción de células presentadoras de antígenos permite el estudio de las interacciones entre células celulares específicas de antígeno en el contexto del ganglio linfático vivo. Aquí demostramos el aislamiento estéril de médula ósea y técnicas de cultivo para la producción de células dendríticas maduras.

Además, seguimos el desarrollo de las células dendríticas desde el primer día hasta el día 11. Este desarrollo se representa con imágenes fijas y en videos de incubadora realizados con el sitio de incus de tecnologías olfativas. Por último, mostramos células dendríticas derivadas de la médula ósea que presentan antígeno de cove a células T OT dos en el ganglio linfático espejo.

Hola, soy Melanie Matthew y estoy en el laboratorio de Micah Halen en la Universidad de California. ¿Alguna vez te has preguntado qué sucede en el interior durante el sondeo mientras tus células están creciendo? ¿Hoy?

Como parte de nuestro protocolo, le mostraremos cómo usar algunos instrumentos en el sitio. El sitio de tinta le permite realizar un seguimiento del crecimiento de los cultivos celulares en su incubadora. En este protocolo, le mostraremos cómo aislar y preparar células derivadas de la médula ósea y agrupadas de ratón.

Así que lo primero que voy a hacer es quitar los huesos del fémur y aislar la médula ósea primero inmovilizar al animal. A continuación, humedezca el animal con etanol al 70%. Haz la primera incisión a lo largo de la línea media del animal.

Luego corta dentro de la pierna como te muestro aquí. Para exponer el tejido muscular por encima del fémur, debes poder apartar el músculo y agarrar el hueso grande del fémur con las pinzas de disección. A medida que sostienes el hueso con las pinzas de disección, desplázate hacia abajo y haz el primer corte justo debajo de la articulación.

A continuación, sube las tijeras a lo largo del fémur y haz que se corte lo más cerca posible del cuerpo. Esto puede resultar en un poco de sangre, especialmente si corta la arteria femoral. Cuando se extirpa el fémur, es extremadamente importante que el hueso se mantenga intacto.

Como se puede ver aquí, los extremos del hueso no se han cortado ni se han roto. Una vez que se haya extirpado el fémur, corte cualquier tejido adicional y coloque el fémur en un plato pequeño de nuestro medio PMI. Al extraer tejido adicional, asegúrese de que el hueso del fémur no se seque.

En este punto, los huesos del fémur deben transferirse a un plato que contenga un 70% de etanol y colocarse en hielo durante cinco a 10 minutos. A los efectos de este vídeo, continuaremos en la mesa de laboratorio. Sin embargo, en esta etapa del experimento, todo debe transferirse a una campana de cultivo de tejidos.

Una vez que los huesos se han empapado en etanol, puede moverlos a un plato más grande con medios estériles para la extracción de la médula ósea. Ahora estamos listos para extraer y resuspender la médula ósea. Llene una jeringa de insulina con medios estériles y colóquela a un lado para su uso posterior.

Sujete el hueso con las pinzas estériles. Sujétalo sobre un plato pequeño para los pedazos desechados y corta la epífisis o los extremos del hueso de cada lado. Coloque la jeringa de insulina en un lado del hueso y enjuague la médula ósea en 15 milésimas de pulgada de medio.

Lave el hueso una o dos veces más hasta que se elimine toda la médula. Una vez que la médula se haya eliminado del hueso, será casi completamente blanca. Coloque el hueso limpio en el plato de desecho y repita el proceso del otro fémur.

Una vez que se haya completado, rompa suavemente cualquier pieza de médula que no se haya roto por el proceso de lavado para crear una suspensión de una sola célula. Esto tomará de cinco a 10 minutos de pipeteo. Coloque una suspensión de una sola celda en un tubo cónico de 50 milésimas de pulgada, lave la placa al menos tres veces con 10 milésimas de pulgada de medio.

Cada vez, gire las células, retire el medio y vuelva a suspender las células frotando firme y enérgicamente los dedos contra la parte inferior del tubo. Para eliminar los glóbulos rojos o glóbulos rojos, realizamos una lisis de agua. Otro método para la eliminación de glóbulos rojos es la lisis de cloruro de amonio.

Ambos métodos han sido descritos en artículos de video anteriores de JoVE. Aislamiento de linfocitos T CD cuatro positivos de ganglios linfáticos de ratón utilizando la purificación Milan max JoVE número nueve y la preparación de factor de crecimiento de células T a partir de citos de rata JoVE. Número 10.

Después de la eliminación de sus glóbulos rojos, ahora están listos para cultivarse a sí mismos. Entonces, antes de llevarlo a través del cultivo de células dendri, me gustaría presentarle el sitio de incus. El sitio del yunque permitirá restar el crecimiento de los cultivos celulares dentro de la incubadora para que podamos observar nosotros mismos cómo se comportan o se comportan mal.

Una vez que se configura un cultivo, se coloca en la bandeja del tamaño adecuado y se desliza el sitio del yunque para cerrarlo. Luego, en su computadora, simplemente establezca el intervalo de tiempo y luego elija los pozos que desea obtener una imagen y deje que el sitio de tinta recopile datos por usted. Las películas que se muestran en este protocolo, demuestran los cambios en la morfología de las células dendríticas in vitro.

Estos videos se exportaron directamente desde el programa del sitio Incus. A medida que las células dendríticas se desarrollan desde el primer día hasta el día 11, se puede ver un verdadero cambio en la morfología a medida que se agrandan y adquieren el fenotipo de la célula dendrítica. Después de lisar los glóbulos rojos y eliminarlos, las células se lavan en medios de células dendríticas primarias y se siembran a 5 millones por mil.

Estas células deben cultivarse inicialmente en medios de cultivo de células dendríticas primarias, y luego las cultivamos en medios DC secundarios, que se complementan con 40 nanogramos por mil IL cuatro y cien nanogramos por mil TNF alfa. Estas citocinas ayudarán en el desarrollo de células dendríticas maduras que se asemejan a las células dendríticas derivadas de monocitos. Así que ahora voy a mostrarte cómo se ven las culturas a medida que se desarrollan y cómo mantenerlas a lo largo del tiempo.

Una vez que haya sembrado las células, puede cultivar las células dendríticas durante 72 horas antes del primer cambio de medio. Así es como se verá su cultivo típico justo después de colocar las células en la placa el primer día. Y aquí hay un vistazo a las células.

En el tercer día, se puede ver que las células han comenzado a adherirse a la placa, pero no han adoptado el fenotipo clásico de células dendríticas. En el cuarto día, retire los medios y agregue 10 milésimas de pulgada de medios primarios frescos de DC aspiración de los medios. Al cuarto día, eliminaremos los linfocitos de cualquier otra célula no adherente.

Ahora pueden volver a colocarse en la incubadora durante otros tres días, siete días después de su siembra inicial. Así es como se verá tu cultura típica. Se puede decir que es hora de dividir las celdas y reemplarlas.

En el séptimo día, las células dendríticas se retiran de la placa aspirando el medio y luego se agregan 300 milimolares de EDTA estéril e incubándolo durante cinco minutos. Luego, la placa se enjuaga repetidamente sosteniéndola en un ángulo de 45 grados y pipeteando la solución de EDTA contra la parte posterior de la placa. Esto se hace durante varios minutos para asegurarse de eliminar todas las células dendríticas adheridas.

Las células se recogen en un tubo cónico de 50 mili y se lavan dos veces con medios de CC secundarios. A continuación, las células se resuspenden y se siembran a 5 millones de células por placa. Las células dendríticas recién replantadas del séptimo día se asientan rápidamente en el fondo de la placa, se adhieren y comienzan a extenderse.

Como se puede ver aquí en el video del sitio de Zichy, este video se tomó en la incubadora en el transcurso de dos días para mostrarles el desarrollo de las células dendríticas desde el replantaje inicial realizado el día siete hasta el día nueve temprano. Morfología Las células dendríticas se pueden activar en el pulso de antígeno agregando dos microgramos por LLPS aquí con cien microgramos para óvulos para su uso con células T purificadas de ratones OT dos, que tienen óvulos específicos CD cuatro células T positivas. Si está usando un antígeno diferente, es importante asegurarse de usar una concentración óptima de antígeno para pulsar sus dcs aquí, el OV y el LPS se agregan a los medios primarios de modo que la concentración final de LPS será de dos microgramos por mil en 20 milésimas de pulgada, y los óvulos serán de cien microgramos por milésima en 20 milésimas de pulgada.

Aquí hay una fotografía de cómo se ve un cultivo típico de células dendríticas en el día 10. Se puede ver en esta fotografía que la morfología es muy típica de una célula presentadora de antígenos. Siempre se debe comprobar el porcentaje de células dendríticas CD 11 C positivas por fax.

Esto es para asegurarse de que tiene un cultivo relativamente puro de células dendríticas para su uso en sus experimentos. Aquí utilizamos el sitio de tinta de los instrumentos SEN para monitorear la activación de las células dendríticas que fueron tratadas con LPS en antígeno pulsado en el día 10. Este video abarca un período de 24 horas inmediatamente después de la adición de LPS y el val y el péptido, y en él las células dendríticas se vuelven más activas y hay algunos cambios morfológicos obvios.

Una vez que sus células dendríticas se han activado en pulso de antígeno, puede volver a recolectarlas mediante incubación con EDTA 300 milimolares y lavado de la placa. Ahora centrifuga tus células, lávalas dos veces con 50 milésimas de pulgada de medio RPMI para eliminar cualquier antígeno adicional y etiquétalas con el tinte rastreador de células adecuado. En este experimento, tomaré imágenes de las células del ganglio linfático inguinal.

Necesitaremos inyectar de dos a 5 millones de células dendríticas por vía dérmica en la región del flanco del ratón que se muestra aquí. A continuación, dejamos pasar 24 horas para que las células dendríticas se alojen en el ganglio linfático de formación. Aquí, en este video, las células dendríticas se marcan con CMF dos hc, un tinte rastreador de células azules.

Se puede ver que las células dendríticas interactúan con las células T marcadas que son específicas del antígeno de la volina. Estas células T están marcadas con ccf SE. También puede usar C-M-T-M-R o cualquiera de los otros tintes rastreadores de células para sondas moleculares. Esta es la etapa temprana de activación de las células T que interactúan con las dcs.

Debido a que son antígenos específicos, se puede ver que las células T se adhieren a los zarcillos de las DC marcadas en azul. Esto concluye nuestro protocolo que demuestra la preparación y el uso de células dendríticas de médula ósea derivadas de ratones en un experimento de imágenes de dos botones. Gracias por mirar y buena suerte con tus propios experimentos.