Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

El objetivo general de este protocolo es desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas murinas para la evaluación de su utilidad inmunoterapéutica en el tratamiento de trastornos autoinmunes, como la esclerosis múltiple. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia con células dendríticas tolerogénicas al proporcionar un método estandarizado para desarrollar y caracterizar funcionalmente las células dendríticas tolerogénicas. Las principales ventajas de esta técnica son que se puede utilizar para el desarrollo exitoso de células dendríticas tolerogénicas y para pruebas de eficacia funcional de células dendríticas tolerogénicas.

Las implicaciones de esta técnica son significativas. Se extienden hacia el desarrollo de la inmunoterapia celular para los trastornos autoinmunes, ya que las células dendríticas tolerogénicas pueden restablecer una respuesta inmunitaria anormal mientras permanecen sujetas a mecanismos intrínsecos de regulación inmunitaria. Después de recolectar los huesos de las patas traseras de ratones C57BL/6 de ocho a 10 semanas de edad, de acuerdo con los protocolos estándar, use cuchillas quirúrgicas y pinzas para diseccionar la mayor cantidad de tejido posible y coloque las tibias y fémures limpios en una placa de cultivo de seis centímetros que contenga etanol al 70%.

Recorte ambos extremos de los huesos con una cuchilla quirúrgica y use una jeringa de tres mililitros, equipada con una aguja de calibre 23, para lavar la médula desde el primer hueso con tres mililitros de PBS en un tubo cónico de 15 mililitros. Cuando se haya recogido toda la médula, centrifugar la suspensión celular y volver a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos. Después de cinco minutos, detenga la lisis con nueve mililitros de PBS y recoja las células por centrifugación.

Vuelva a suspender el pellet de células blancas de médula ósea en 10 mililitros de medio de cultivo y filtre las células a través de un colador de células de 40 micrómetros en un tubo nuevo. Ajustar las celdas a una concentración de una por 10 a la sexta célula por mililitro en medio de cultivo suplementado con GM-CSF e IL-4. Y coloque tres mililitros de células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos para una incubación de tres días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Al tercer día, lavar las células de cada pocillo con dos mililitros de PBS y agitar suavemente para eliminar las células no adherentes. A continuación, alimente las células con tres mililitros de medio de cultivo fresco suplementado con GM-CSF e IL-4 y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular, añadiendo tres mililitros más de medio de cultivo fresco, suplementado con citocinas a cada pocillo después de dos días. En el séptimo día de cultivo, coloque el plato sobre hielo.

Después de 10 minutos, pipetee suavemente el medio de cultivo en cada pocillo para desalojar las células dendríticas inmaduras derivadas de la médula ósea en suspensión. A continuación, agrupe las células para su recogida por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado de medio de cultivo fresco para su posterior análisis. Para medir la proliferación singénica de células T, primero use el extremo posterior de un émbolo de jeringa de tres mililitros para triturar el bazo de un ratón OT2 C57BL/6 de ocho a 10 semanas de edad a través de un colador de células de 40 micrómetros y enjuague el colador con PBS.

Granule la suspensión celular agrupada por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 400 microlitros de tampón de clasificación de células magnéticas y 100 microlitros de cóctel de biotina-anticuerpo de células T CD4 positivas a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Al final de la incubación, agregue 300 microlitros de tampón de clasificación y 200 microlitros de perlas anti-biotina a las células durante una incubación de 10 minutos y cuatro grados Celsius y coloque una columna de perlas magnéticas y un filtro de preseparación en un imán de separación celular de tamaño adecuado. Enjuague la columna con tres mililitros de tampón de clasificación y agregue nueve mililitros de tampón de clasificación a las celdas.

Después de la centrifugación, vuelva a suspender la célula y el gránulo de perlas en tres mililitros de tampón de clasificación y agregue la suspensión celular a la columna para recoger el eluido de células T CD4 positivas en un recipiente apropiado. A continuación, lave la columna con otros tres mililitros de tampón de clasificación, recoja el flujo y coloque las células T en hielo. Para el aislamiento singénico de células pandendríticas esplénicas, coloque el bazo de un ratón C57BL/6 de ocho a diez semanas de edad en una placa de cultivo de seis centímetros y use una jeringa de un mililitro, equipada con una aguja de calibre 25, para inyectar un mililitro de solución de colagenasa D en el bazo dos veces.

A continuación, utilice unas tijeras para cortar el bazo en trozos pequeños e incubar los trozos agitándolos a temperatura ambiente durante 25 minutos. Al final de la incubación, agregue 500 microlitros de EDTA 0.5 molar a la suspensión de tejido para una incubación final de cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, use el extremo posterior de un émbolo de jeringa de tres mililitros para triturar la suspensión del bazo a través de un colador de células de 40 micrómetros y recoja las células por centrifugación.

Vuelva a suspender el pellet en 350 microlitros de tampón de clasificación de células magnéticas, 50 microlitros de reactivo de bloqueo del receptor Fc y 100 microlitros de cóctel de biotina-anticuerpo de células pandendríticas para una incubación de 10 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lavar las células en nueve mililitros de tampón de clasificación y volver a suspender el pellet en 800 microlitros de tampón de clasificación fresco con 200 microlitros de perlas anti-biotina a cuatro grados centígrados durante 10 minutos para el aislamiento de la población de células pandendríticas esplénicas mediante clasificación magnética de perlas, como se acaba de demostrar. Resuspender las células a una concentración de dos veces 10 a la quinta células dendríticas por mililitro y tratarlas con la concentración experimental adecuada del triterpenoide de interés durante una hora a 37 grados centígrados.

Durante el último tercio de la incubación, vuelva a suspender las células T a una concentración de 10 a la séptima célula por mililitro en un CFSE micromolar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, lavar las células con PBS y reajustar el volumen hasta una concentración final de dos veces 10 a la sexta célula T por mililitro. Co-cultivo de 100 microlitros de las células dendríticas tratadas con 100 microlitros de las células T CD4 positivas marcadas con CFSE en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y añadir 100 nanogramos por mililitro de péptido OVA 323-329 a las células, midiendo la intensidad de CFSE de las células T mediante citometría de flujo después de dos o tres días de incubación.

Las células progenitoras de la médula ósea cultivadas en medio completo, en presencia de GM-CSF e IL-4, exhiben una morfología de células dendríticas inmaduras después de seis días de cultivo. El análisis de las células dendríticas inmaduras derivadas de la médula ósea en séptimo día revela la expresión robusta de CD11c, un marcador específico de células dendríticas murinas, por parte de la mayoría de las células cultivadas. A pesar de la falta de efecto sobre la expresión de los marcadores de maduración inducidos por LPS, las células dendríticas derivadas de la médula ósea muestran un perfil de células dendríticas tolerogénicas en respuesta al tratamiento con CDDO-DFPA, como lo demuestra una reducción significativa en la expresión génica proinflamatoria y una mayor expresión génica de citocinas antiinflamatorias, incluso después de la estimulación con LPS.

Además, se observa una reducción significativa en la proliferación singénica de células T específicas de OVA en cocultivos in vitro en los que la OVA se presenta mediante células dendríticas tratadas con CDDO-DFPA e in vivo, como lo demuestra una progresión tardía a encefalomielitis autoinmune experimental después de la inyección de células dendríticas tratadas con CDDO-DFPA pulsadas con MOG, lo que confirma aún más el fenotipo tolerogénico de estas células. Una vez que se ha dominado esta técnica, las células dendríticas tolerogénicas se pueden desarrollar en ocho días, si los experimentos se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las células dendríticas tolerogénicas no son homogéneas.

Su fenotipo celular depende de la naturaleza de los agentes utilizados para la inducción de su tolerancia. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis citométrico de flujo detallado, para responder preguntas adicionales sobre la energía o apoptosis de las células T antigénicas específicas inducidas por células dendríticas tolerogénicas o la capacidad de diferenciación de las células T. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar células dendríticas tolerogénicas funcionalmente activas utilizando agentes conocidos o cómo probar la capacidad de nuevas sustancias para inducir estas células.