Name: Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas murinas para evaluar su utilidad inmunoterapéutica en trastornos autoinmunes como la esclerosis múltiple. Este protocolo estandarizado facilita la investigación en inmunología celular.

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Agradecemos a productos farmacéuticos Jalale para proporcionar CDDO-DFPA. También reconocemos el apoyo de la Jane y Lee Seidman Cátedra de innovación de cáncer pediátrico (John Letterio). Este trabajo fue financiado por el Departamento de defensa [W81XWH-12-1-0452]; la iniciativa de investigación de cáncer en adultos, Angie Fowler adolescentes y jóvenes, en el caso centro integral del cáncer; y el premio académico graduado de Callahan Hsi-Ju Wei de F.J. Callahan Fundación.

Todos los estudios se realizaron en cumplimiento de procedimientos aprobados por del caso Western Reserve University School of Medicine institucional Animal cuidado y uso.
1. preparación de células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDCs)
<ol><li>Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos a través de autoclave y realizar el experimento en clase con los procedimientos de seguridad apropiados de seguridad biológica II.</li>
	<li>Eutanasia a ratones C57BL/6 8-10 semanas de edad mediante el uso de CO2 cámara. Coloque el ratón sobre una tabla de disección y enjuagar con etanol al 70%. Impuestos especiales-tibia-peroné y fémur huesos usando una tijera quirúrgica y colocarlos con etanol al 70% en una placa de cultivo de 10 cm.</li>
	<li>Utilizar hojas para bisturí y pinzas para disecar tejido lejos tanto como sea posible en la tapa del 10 cm plato de la cultura y aislar las tibias y fémures colocarlos con etanol al 70% en una placa de cultivo de 6 cm.</li>
	<li>Utilice láminas quirúrgicas para recortar ambos extremos de la tibia y fémur. Use 3 mL de PBS en jeringa de 3 ml con una aguja de 23G para vaciar el contenido de médula ósea de uno de los extremos de los huesos a un tubo cónico que contiene 12 ml de PBS. Repetir la operación 3 x cada extremo de los huesos.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con 1 ml del tampón lisis de ACK por 5 minutos eliminar las células de sangre rojas.</li>
	<li>Añadir 9 ml de PBS para diluir el buffer lisis ACK y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender con 10 ml medio de cultivo (RPMI-1640 más L-glutamina, 10% FBS, 1% no esenciales aminoácidos (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoetanol y 5% penicilina/estreptomicina). Nota: Nivel de endotoxinas debe ser inferior a 0,1 UE/ml de SBF.</li>
	<li>Pasar la suspensión celular a través de un tamiz de 40 μm celular y tomar 20 μl de la suspensión celular y se mezclan con 80 μl de trypan azul para contar el número de células vivas mediante el uso de citometría.</li>
	<li>Ajustar el número de celular a 1 x 106 células/ml con GM-CSF de 15 ng/ml y 10 ng/ml de IL-4.</li>
	<li>3 ml de 1 x 106 células/ml en cada pocillo de la placa de 6 pozos de la placa e incubar a las células a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad en la incubadora de CO2 . Nota: Las células de la médula ósea de un ratón es alrededor de 3-5 x 107 células, indicando que se puede colocar de 2 a 3 placas de 6 pozos.</li>
	<li>El día 3, quitar todo medio de cultivo de 3 ml de cada bien, agregar 2 ml PBS fresco en cada pozo, y luego agitar suavemente la placa para asegurarse de eliminar todas las células no adherentes.</li>
	<li>Vuelva a colocar 3 ml medio de cultivo fresco con GM-CSF de 15 ng/ml y 10 ng/ml de IL-4 en cada pozo. Incube las células a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad en la incubadora de CO2 .</li>
	<li>El día 5, directamente agregar otro medio de cultivo fresco de 3 ml con GM-CSF de 15 ng/ml y 10 ng/ml de IL-4 en cada pozo. Incube las células a 37° C, 5% CO2 y 95% de humedad en la incubadora de CO2 . Nota: El volumen total en cada pozo es ahora 6 ml.</li>
	<li>En el día 7, poner toda la placa de hielo durante 10 minutos. Pipetee suavemente el medio de cultivo en cada pozo para desalojar el ligeramente adherente BMDCs como CDI en suspensión. Nota: Los macrófagos adherentes estén fijados a la placa. Procedimientos y suavemente la baja temperatura son la clave para evitar la activación de la DC para más experimentos.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 5 minutos y resuspender con medio fresco de cultivo para experimentos adicionales. Nota: BMDCs puede identificarse con el anticuerpo marcado con fluorescencia de CD11c por citometría de flujo y mostramos nuestra estrategia bloquea de BMDCs para otros experimentos en la figura 1.</li>
</ol>2. caracterizar el perfil de proteína y gen TolDC
<ol><li>Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por pozo de placa de 6 pozos con medio de cultivo en la presencia o ausencia de 100-400 nM DFPA CDDO para incubar 1 h a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad en la incubadora de CO2 . Nota: CDDO-DFPA, un triterpenoide sintético, es un factor nuclear (derivados del eritroide 2) - como - 2 inductor de factor (Nrf2) y el inhibidor del factor nuclear-κB (NF-κB). Aplicar a otros agentes para la inducción de TolDCs de la CDI, como IL-10, vitamina D3, dexametasona o Bahía 11-7085 y modificar este paso a una condición óptima para cada agente.</li>
	<li>Añadir 10 o 100 ng/ml de LPS para incubar 4-24 horas para inducir la mDCs (tiempo de incubación es diferente debido a la medición de mRNA o proteína).</li>
	<li>Pipetear el medio de cultivo en cada pozo y la suspensión de células de la cosecha utilizando la pipeta de 1 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos recoger las células y del sobrenadante, respectivamente.</li>
	<li>Analizar los ligandos de la superficie de los pellets de células por citometría de flujo, como ligandos estimulantes: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL o ligandos inhibidores: PD-L1, PD-L2, ILT3 ILT4.</li>
	<li>Aislar el RNA de los pellets de célula y analizar las RNA y sobrenadante muestras de los niveles del cytokine perfil y gene y proteína por PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y ELISA, respectivamente. Nota: por ejemplo, citoquinas proinflamatorias: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 y IL-23 o antiinflamatorias citoquinas: IL-4, IL-10, IL-15, el TGF-β1 y la HO-1.</li>
</ol>3. evaluar la función de TolDCs In Vitro e In Vivo
<ol><li>
Ensayo de Syngeneic de la proliferación de células T
	<ol>
<li>Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos a través de autoclave y realizar el experimento en clase con los procedimientos de seguridad apropiados de seguridad biológica II.</li>
		<li>Preparar el tampón de Mac utilizando 0.5% albúmina de suero bovino (BSA) y 2 mM de EDTA en 500 ml de PBS. Esterilizar el búfer por filtración a través de un filtro de 0.2 μm. Nota: Mantenga el buffer en el hielo durante el siguiente experimento.</li>
		<li>Para obtener CD4+ T células, eutanasia ratones transgénicos de OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 semanas de edad mediante el uso de CO2 cámara. Coloque el ratón sobre una tabla de disección y enjuagar con etanol al 70%. Aislar el bazo del lado izquierdo del abdomen mediante el uso de fórceps y tijeras quirúrgicas.</li>
		<li>Poner el bazo con 2 ml de PBS en una placa de cultivo de 6 cm y la parte posterior de la varilla de empuje de la jeringa de 3 ml para picar el bazo por pasar un tamiz de 40 μm células.</li>
		<li>Recoge las suspensión y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 400 μl de tampón de MACS.</li>
		<li>Añada 100 μl de CD4+ T Cell biotina anticuerpo cóctel a 4° C por 5 minutos. Nota: El cóctel de anticuerpos se une a otros tipos de células excepto CD4+ T de las células, tales como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC de clase II, Ter-119 y TCRγ/δ.</li>
		<li>Añadir 300 μl de tampón de MACS y 200 μl de anti-biotina granos (Tabla de materiales) a 4° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Lugar la columna compuesta de esferas ferromagnéticas (Tabla de materiales) y el filtro de separación previa en el magnético campo y enjuagar luego con 3 ml de tampón de MACS.</li>
		<li>Añadir 9 ml de tampón de MACS en las células y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 3 ml de tampón de MACS y se aplican sobre la columna. Recoge paso con CD4+ T las células.</li>
		<li>Lavar la columna con otro 3 ml de tampón de MACS y recoger también el flujo a través.</li>
		<li>Para obtener el pan bazo DCs, eutanasia ratones C57BL/6 8-10 semanas de edad mediante el uso de CO2 cámara. Coloque el ratón sobre una tabla de disección y enjuagar con etanol al 70%. Aislar el bazo del lado izquierdo del abdomen mediante el uso de fórceps y tijeras quirúrgicas. Poner el bazo en una placa de cultivo de 6cm que contiene 2 ml de solución de colagenasa D (colagenasa de 2 mg/ml D disuelto en HBSS conteniendo calcio, magnesio).</li>
		<li>Inyectar 1 ml de solución de colagenasa D el bazo dos veces con una jeringa de 1 ml y una aguja de 25G. Corte del bazo en trozos pequeños con unas tijeras pequeñas.</li>
		<li>Agitar e incubar a temperatura ambiente durante 25 minutos.</li>
		<li>Añadir 500 μl de EDTA de 0,5 M a temperatura ambiente durante 5 minutos. Nota: Los pasos de 3.1.13-3.1.14 son fundamentales para aumentar el rendimiento de DCs.</li>
		<li>Ahora uso la parte trasera de la varilla de empuje de la jeringa de 3 ml a moler la mezcla de bazo por pasar un tamiz de 40 μm células y recoger la suspensión de células por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 350 μl de tampón de MACS, 50 μl de reactivo de bloqueo de FcR y 100 μl de Pan biotina anticuerpo de célula dendríticas cóctel a 4° C durante 10 minutos. Nota: El anticuerpo cóctel contra los antígenos que se expresan no por DCs.</li>
		<li>Lavar las células añadiendo 9 ml de tampón de MACS y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 800 μl de tampón Mac y agregar 200 μl de anti-biotina cuentas a 4 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Repita los pasos del 3.1.9-3.1.11 para recoger DCs.</li>
		<li>Lavar la columna con otro 3 ml de tampón de Mac dos veces y también recoger el flujo a través.</li>
		<li>Tratar el 2 x 105 DCs/ml en la presencia o ausencia de células de T de 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C por 1 hr. por separado, etiqueta el CD4+ (1 x 107/ml) con 1 μM CFSE a 37 ° C durante 15 minutos, lavar con PBS y vuelva a ajustar el volumen para obtener la concentración final en 2 x 106 T células/ml.</li>
		<li>A continuación, en una placa de 96 pocillos, co cultura 100 μl de las células dendríticas tratadas con el mismo volumen de CFSE-labeled CD4+ T de las células, tanto de los pasos anteriores para conseguir 1:10 cociente. Ahora se añadirá 100 péptidos de ovoalbúmina (OVA) 323-329 ng/mL por pozo y medir la intensidad de la CFSE de los linfocitos T por citometría de flujo 2-3 días de incubación. Nota: El número de células y el cociente de DCs y T, las células han sido optimizadas de nuestro anterior trabajo37.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pasivo de inducir EAE inyectando BMDCs pulsada con la glicoproteína del Oligodendrocyte del Myelin (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por pozo de placa de 6 pozos con medio de cultivo en la presencia o ausencia de 100-400 nM DFPA CDDO para incubar 1 hora.</li>
		<li>Añadir 10 ng/ml de LPS para incubación de 24 hrs.</li>
		<li>Añadir 100 μg/ml de MOG (35-55) para incubación de 4 horas.</li>
		<li>La cosecha la suspensión y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células con PBS y contar las células.</li>
		<li>Inyectar por vía subcutánea 200 μl de 2 x 106 células a ratones C57BL/6 femeninos de 8-10 semanas (100 μl en cada pata trasera).</li>
		<li>En el día de la inyección de BMDC y 48 hrs. más tarde, inyectar 200 ng de toxina de pertussis (PTX) en cada ratón.</li>
		<li>Repita los pasos 3.2.6-3.2.7 una vez por semana durante 4 semanas consecutivas.</li>
		<li>Evaluar los síntomas clínicos de EAE diario utilizando criterios estándar37 (final 0.5-cojera, blando 1 cola, 2-moderada extremidades debilidad, debilidad de extremidades 3-severo, parálisis de extremidades 4-completo, estado 5-tetraplejía o moribundo, 6-muerte).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Este papel describe un protocolo eficiente que puede utilizarse para reproducible en generar CDI y posteriormente diferenciarlas en TolDCs, y proponemos que esto se puede aplicar para evaluar la capacidad de los nuevos agentes diana molecular para inducir a la TolDC fenotipo. Como se describe en este informe, hemos seguido una secuencia en la que Analizábamos primero TolDC expresión de ligandos de superficie por citometría de flujo, seguido de una evaluación del perfil de citoquina de CC medida por qRT-PCR y ELISA. Final...

Las células dendríticas (DCs) son una parte integral del sistema inmune innato y primero fueron descubiertas y caracterizadas por Ralph Steinman y Zanvil Cohn en 1973 como el principal antígeno profesional que presenta las células1. DCs han demostrado jugar un papel importante en la activación inmune por presentar antígenos procesados a las células T y las células B por medio de complejos de histocompatibilidad (MHC) en órganos linfoides secundarios para vincular los sistemas inmunitarios innato y adaptativo2. En el sistema inmune mamífero, hay al menos dos categorías de DCs que se han descrito como mieloide DCs plasmacytoid DCs (PDC)3. DCs mieloides, también conocidas como DCs convencionales (CDC), se caracterizan por la expresión de CD11c y puede ser distinguido como inmaduros DCs (iDCs) in vitro de células progenitoras de médula ósea o de monocitos de sangre periférica utilizando factor del granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) e IL-4 en murinas y humanas especies, respectivamente4.
Señales de activación de 'peligro', tales como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o patrones moleculares asociados a daño (húmedo), conducirá CDI maduración hacia DCs inmunogénicas como DCs madurados (mDCs) vía atar varios receptores de reconocimiento de patrón la superficie DC5. Inmunogénicas DCs más prime ingenuo T proliferación y diferenciación celular a través de la regulación al alza de MHCII2ligandos coestimuladoras (CD80, CD86 y CD40)6, citocinas y otros mediadores solubles7. Una cascada de producción pro-inflamatoria del mediador de DCs inmunogénica es esencial para la diferenciación de células T mediada por citocinas. Por ejemplo, IFN-γ y la IL-12 son necesarios para la diferenciación de Th18 e IL-1, IL-6 e IL-23 son críticos para ingenuos polarización de la célula de T hacia Th17 células9. Aunque DCs madurados reaccionan ante antígenos extraños, activación incontrolada de la DC por los antígenos del uno mismo puede hacer ablación de la tolerancia y fomentar el desarrollo de enfermedades autoinmunes mediante la generación de células autorreactivas T cuya activación conduce a la destrucción del tejido10 .
Los informes recientes han proporcionado evidencia clara de la plasticidad de la DC, ejemplificado por su capacidad para interactuar con diferentes señales dentro de su microambiente del tejido y diferenciar en subgrupos distintos efector supresor DC. Los mediadores antiinflamatorios, tales como IL-1011, TGF-β12y13 de la HO-1 han demostrado jugar un papel importante en la supresión inmune induciendo tolerogénicas DCs (TolDCs). Estos TolDCs adquirir funciones reguladoras y suprimir la proliferación de la célula de T14. Además, la falta de estimulación conjunta por DCs y la producción de mediadores antiinflamatorios de TolDCs contribuyen a la inducción de células T reguladoras (Tregs) y también inhibe Th1 y Th17 diferenciación y expansión15. En más allá de dos décadas, se ha reportado el potencial terapéutico de TolDCs por varios investigadores. En estos estudios, la administración del ex-vivo genera síntomas patológicos TolDCs mejorada no sólo en diversos modelos preclínicos de enfermedades autoinmunes16 pero también condujo al desarrollo de tolerancia inmunológica en pacientes17 ,18. Curiosamente, hoy en día la terapia de TolDCs ha sido considerada como un enfoque alternativo o complementario para enfermedades autoinmunes en varios ensayos clínicos, incluyendo tipo 1 diabetes mellitus19-artritis reumatoide20, 21, esclerosis múltiple (EM)22,23,24y enfermedad25 de Crohn.
Hay una variedad de protocolos que han sido empleados para el desarrollo de TolDCs y varios laboratorios han informado de métodos para la generación y caracterización fenotípica de TolDCs. Estos métodos pueden utilizarse para generar reproducible TolDCs en vitro de progenitores hematopoyéticos y mantener estable en un tolerogénicas estado en vivo26,27,28,29. El CDI se puede convertir en TolDCs por la exposición a diversos agentes farmacológicos inmunomoduladores o citoquinas antiinflamatorias. Por ejemplo, la vitamina D3 es un conocido agente farmacológico conocido para aumentar la producción de IL-10 y suprimir la secreción de IL-12 de DCs y así potenciar su función inmunosupresora30. Por otra parte, cuando DCs están expuestos a estímulos inflamatorios potentes, como los lipopolisacáridos (LPS), varios agentes farmacológicos tales como dexametasona31, rapamicina32y33 de los corticosteroides han demostrado para inducir la Fenotipo TolDC reduciendo la expresión de superficie de DC de CD40, CD80, CD86 y MHCII34. IL-10 y TGF-β son las citocinas antiinflamatorias más estudiado para inducir tolerancia de DC35 y la exposición concomitante a cada una de estas citoquinas se han demostrado para inducir un fenotipo tolerogénicas en DCs36.
Desde el tolerogénicas que DC se define por características funcionales en lugar de marcadores fenotípicos, hay una gran necesidad de desarrollar un método consistente para celular y caracterización funcional de TolDCs. Por otra parte, un protocolo riguroso y consistente debe establecerse para la constante evaluación y caracterización del fenotipo DC tolerogénicas sea eficaz y reproducible comparar la capacidad de nuevos agentes para inducir el fenotipo de TolDC en el laboratorio. Aquí proporcionamos un protocolo detallado con métodos paso a paso para aislar CDI de progenitores hematopoyéticos de ratones y posteriormente analizar la eficacia de nuevos agentes bajo evaluación de su capacidad para convertir CDI TolDCs, proporcionando una sólida caracterización fenotípica y funcional de TolDCs in vitro e in vivo. Esta descripción incluye un elaborado método para caracterizar la TolDCs por sus ligandos de superficie, perfil del cytokine y funciones inmunosupresoras en vitro. También ofrecemos un ejemplo de un método para explorar la posible aplicación terapéutica de estas TolDCs en un modelo preclínico de la EM, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Este protocolo establecido ayudará a los investigadores a evaluar la capacidad de nuevos agentes para promover la inducción de TolDCs y facilitará el esfuerzo por ampliar el alcance del desarrollo terapéutico TolDC.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>síntesis interna</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Ratón GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>Diferenciación BMDC</td></tr><tr><td>Ratón IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td><td>Diferenciación BMDC</td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos (LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>Cultivo</td></tr> <tr><td>celular&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>de toxina para la tos ferina (PTX)</td><td>R& D systems</td><td>3097</td><td>EAE inducción</td></tr><tr><td>MOG (35&ndash; 55) péptido</td><td>21stCentury Bioquímicos</td><td>en síntesis interna</td><td>EAE inducción</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>RPMI-1640 más L-glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Aminoácido no esencial (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific 15630080</td><td></td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>de penicilina/estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>40 &#956; filtro de células m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Aislamiento celular</td></tr><tr><td>CD80 BD conjugado con PE</td><td>Biosciences</td><td>557227</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>de flujo CD86 BD conjugada con PE Biosciences</td><td></td><td>555665</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>PD-L1 conjugada con PE</td><td>BioLegend 124307 Citometría</td><td></td> de <td>flujo</td></tr><tr><td>MHCII conjugada con APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>CD11c conjugado con APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>Isotipo emparejado PE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>Isotipo emparejado APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>Ensayo de proliferación de células T</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de células pandendríticas</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875 Ensayo de proliferación de</td><td>células</td></tr><tr><td>T Reactivo de bloqueo FcR</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875 Ensayo de proliferación de</td><td>células T</td></tr><tr><td>Cóctel pandendrítico de biotina-anticuerpo</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Ensayo de proliferación de células T</td></tr><tr><td>Microperlas anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875 Ensayo de proliferación de</td><td>células</td></tr><tr><td>T CD4+ Kit de aislamiento de células T</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454 Ensayo de</td><td>proliferación de células T</td></tr><tr><td>CD4+ Cóctel de biotina-anticuerpo de células T</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454 Ensayo de proliferación de</td><td>células T</td></tr><tr><td>Microperlas anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454 Ensayo de</td><td>proliferación de linfocitos</td></tr><tr><td>T Tampón de lisado ACK</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>Diferenciación de BMDC</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Ensayo de proliferación de linfocitos T</td></tr><tr><td>jeringa de 3 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC de diferenciación</td></tr><tr><td>Aguja 25G</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Ensayo de proliferación de linfocitos T</td></tr><tr><td>Aguja 23G</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>diferenciación BMDC</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>Ensayo de proliferación de linfocitos T</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Ensayo de proliferación de linfocitos</td></tr><tr><td>T LS Column</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401 Ensayo de proliferación de</td><td>células T</td></tr><tr><td>Filtro de preseparación Miltenyi</td><td>Biotec Inc.</td><td>130-095-823 Ensayo de proliferación de</td><td>células T</td></tr><tr><td>colagenasa D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>11088858001</td><td>Ensayo de proliferación de células T</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>Ensayo de proliferación de células T</td></tr><tr><td>péptido de ovoalbúmina (OVA) 323&ndash; 329</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>O1641</td><td>Ensayo de proliferación de células T</td></tr><tr><td>IFN-& gamma de ratón; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Mm01168134_m1 Ratón qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-12a Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>Ratón qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R& D systems</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Ratón EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&alpha; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Ratón TNF-&alpha; Kit ELISA de Quantikine R</td><td>& D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Ratón IL-6 Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Ratón IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R& Sistemas D</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-hemo oxigenasa 1</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-&beta;-actina</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Analizador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>Citometría</td> de <td></td> flujo</tr></tbody></table>

desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

El sistema inmune funciona manteniendo un equilibrio ajustado entre la coordinación de las respuestas contra antígenos extraños y mantener un estado insensible contra antígenos del uno mismo, así como los antígenos derivados de microorganismos comensales. La interrupción de esta homeostasis inmune puede conducir a la inflamación crónica y al desarrollo de autoinmunidad. Las células dendríticas (DCs) son las células presentadoras de antígeno profesionales del sistema inmune innato implicado en la activación de las células Naive T para iniciar la respuesta inmune contra antígenos extraños. Sin embargo, el DCs se pueden distinguir también en TolDCs que actúan para mantener y promover la tolerancia de la célula de T y para suprimir células efectoras contribuyendo con el desarrollo de cualquier condiciones de inflamación crónica o autoinmune. El reciente avance en nuestra comprensión de TolDCs sugiere que se puede conseguir tolerancia DC modulando sus condiciones de diferenciación. Este fenómeno ha conducido a un enorme crecimiento en el desarrollo de terapias TolDC para numerosos trastornos del sistema inmune causadas por romper en tolerancia inmunológica. Exitos estudios en modelos murinos de autoinmunidad preclínicos más han validado la utilidad inmunoterapéutico de TolDCs en el tratamiento de los trastornos autoinmunitarios. Hoy en día, TolDCs se han convertido en una herramienta prometedora de la inmunoterapia en la clínica para reintegro de tolerancia inmunológica en varios desordenes inmunes apuntando las respuestas autoinmunes patógenas dejando inmunidad protectora intacta. Aunque una variedad de estrategias ha sido propuesta por varios laboratorios para inducir TolDCs, no hay consistencia en la caracterización del fenotipo celular y funcional de estas células. Este protocolo proporciona a una guía paso a paso para el desarrollo de la médula ósea DCs en grandes números, un método único utilizado para diferenciarlos en TolDCs con un triterpenoide sintético 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic difluoro-propil-amida del ácido (CDDO-DFPA) y las técnicas utilizadas para confirmar su fenotipo, incluyendo análisis de firmas moleculares esenciales de TolDCs. Por último, os mostramos un método para evaluar la función de TolDC por prueba su respuesta inmunosupresora en vitro e in vivo en un modelo preclínico de la esclerosis múltiple.

La diferenciación y selección de BMDCs:
Las células progenitoras de médula ósea fueron cultivadas en Medio RPMI completo en presencia de GM-CSF e IL-4 se diferencian en CDI por 7 días (figura 1A). El día 1, las células eran de tamaño pequeñas y demostraron morfología esférica. Lavado con PBS antes de la sustitución de medio fresco en 3 días ayudó a las células a clusters de forma y ...

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

El objetivo general de este protocolo es desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas murinas para la evaluación de su utilidad inmunoterapéutica en el tratamiento de trastornos autoinmunes, como la esclerosis múltiple. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia con células dendríticas tolerogénicas al proporcionar un método estandarizado para desarrollar y caracterizar funcionalmente las células dendríticas tolerogénicas. Las principales ventajas de esta técnica son que se puede utilizar para el desarrollo exitoso de células dendríticas tolerogénicas y para pruebas de eficacia funcional de células dendríticas tolerogénicas.Las implicaciones de esta técnica son significativas. Se extienden hacia el desarrollo de la inmunoterapia celular para los trastornos autoinmunes, ya que las células dendríticas tolerogénicas pueden restablecer una respuesta inmunitaria anormal mientras permanecen sujetas a mecanismos intrínsecos de regulación inmunitaria. Después de recolectar los huesos de las patas traseras de ratones C57BL/6 de ocho a 10 semanas de edad, de acuerdo con los protocolos estándar, use cuchillas quirúrgicas y pinzas para disecc

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Este video muestra la generación de células dendríticas inmaduras, maduras y tolerogénicas, o CD, a partir de monocitos humanos. La incubación de monocitos con factores de crecimiento y citocinas conduce a la producción de CD inmaduras. En respuesta a las moléculas inmunorreguladoras, las CD inmaduras se diferencian en CDs tolerogénicas y maduras.

Generación de células dendríticas inmaduras, maduras y tolerogénicas a partir de monocitos

Este video muestra un método de conversión de células dendríticas (CD) en CD tolerogénicas (TolDC) utilizando un agente farmacológico inmunomodulador. Esta conversión se confirma mediante la evaluación de la función de TolDC a través de su efecto inmunosupresor sobre las células T CD4+.

Efecto de un agente farmacológico inmunomodulador en la interacción entre células dendríticas y linfocitos T CD4+

Este protocolo describe los procedimientos experimentales para evaluar la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides en las placas de Peyer a partir de progenitores comunes de células dendríticas, usando técnicas que implican el aislamiento mediada por FACS de células, la transferencia génica hidrodinámica, y análisis de flujo de subconjuntos inmunes en las placas de Peyer.

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

En este estudio presentamos un sistema de cultivo in vitro que puede generar eficientemente pDCs mediante el co-cultivo de progenitores linfoides comunes con células alimentadoras AC-6 en presencia de ligando Flt3.

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Las células dendríticas inmaduras pueden diferenciarse selectivamente en células dendríticas tolerogénicas o maduras para regular el equilibrio entre inmunidad y tolerancia. Este trabajo presenta un medio para generar a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (moDCs), in vitro tolerogénicas y moDCs maduras que difieren en fenotipos metabólicos.

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Aquí proporcionamos un protocolo para el cribado de posibles factores de transcripción implicados en el desarrollo de células dendríticas (DC) mediante la transducción lentiviral de shRNA para obtener líneas celulares de derribo estables para la diferenciación in vitro de DC.

Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro

Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

Describimos un procedimiento para evaluar la capacidad de los agentes farmacológicos para generar células dendríticas tolerogénicas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos naïve in vitro y validar su potencia mediante la generación de células T reguladoras autólogas.

Un método simple y eficiente para probar agentes inmunomoduladores para la generación de células dendríticas tolerogénicas a partir de monocitos CD14+ humanos

Aprende a desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas murinas para evaluar su utilidad inmunoterapéutica en trastornos autoinmunes como la esclerosis múltiple. Este protocolo estandarizado facilita la investigación en inmunología celular.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

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