Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

La principal ventaja de esta técnica es que el animal puede crecer libremente dentro del dispositivo y puede quedar atrapado para obtener imágenes de alta resolución. El dispositivo se puede reutilizar varias veces. Al fabricar el dispositivo, la limpieza es el factor más importante para poder fabricar dispositivos libres de polvo para evitar fugas durante las operaciones del dispositivo.

Para comenzar el patrón de diseño uno para la capa de flujo y el patrón dos para la capa de control utilizando formas rectangulares en un software de procesamiento de textos e imprimir las máscaras fotográficas con la ayuda de un trazador láser con un tamaño mínimo de característica de ocho micrómetros en película a base de poliéster. Corte las obleas de silicio en trozos cuadrados de 2,5 centímetros de altura y anchura. Límpielos con hidróxido de potasio al 20% durante un minuto y enjuague las obleas en agua desionizada.

Utilice una oblea para el flujo y la otra para la capa de control. Seque las piezas con 14 gas nitrógeno comprimido P-S-I seguido de deshidratación en una placa caliente a 120 grados centígrados durante cuatro horas. Después de enfriar, tome una pieza de silicio, colóquela en el mandril de un codificador de centrifugado y encienda la aspiradora para mantener la oblea en su lugar.

Ponga aproximadamente 20 microlitros de hexametildisilano en la pieza de silicio y cúbrala con el codificador de centrifugado a 500 R-P-M durante cinco segundos seguido de 3000 R-P-M durante 30 segundos. Para obtener un espesor fotorresistente uniforme de aproximadamente 40 micrómetros específicos para la capa de flujo, cubra la oblea de silicio con aproximadamente 1,5 mililitros de fotorresistencia negativa con un codificador de espín a 500 R-P-M durante cinco segundos seguido de 2000 R-P-M durante 30 segundos. Repita el recubrimiento de la pieza de silicio con hexametildisilano y fotorresistencia negativa para la segunda oblea para obtener un espesor fotorresistente uniforme de aproximadamente 40 micrómetros específicos para la capa de control.

Alternativamente, para aumentar el grosor de la capa de flujo a aproximadamente 80 micrómetros para animales más viejos, cubra las obleas de silicio con aproximadamente 1,5 mililitros de fotorresistencia negativa dos, utilizando el codificador de espín a 500 R-P-M durante cinco segundos seguido de 2000 R-P-M durante 30 segundos. Hornea las dos piezas de silicona previamente recubiertas de fotorresistencia en una placa caliente a 65 grados centígrados durante un minuto seguido de 95 grados centígrados durante 10 minutos. Después del enfriamiento, coloque piezas de silicona suavemente horneadas en la etapa de exposición del iluminador U-V con la superficie recubierta de fotorresistencia frente a la lámpara U-V.

Exponga las dos piezas por separado a U-V durante 15 segundos usando una lámpara de 200 vatios a través de una máscara fotográfica con patrones uno y dos para obtener capas de flujo y control respectivamente. Hornea las dos piezas de silicona expuestas como se describió anteriormente con capas recubiertas hacia arriba. Después de enfriar las piezas, desarrolle los patrones remojando las piezas de silicona en la solución de revelador fotoresistente durante 20 minutos.

Una vez que el patrón sea visible, enjuague las piezas con alcohol isopropílico puro y seque suavemente con gas nitrógeno. Mantenga las piezas de silicona en un desecador con la superficie recubierta hacia arriba. Exponga las piezas a vapores de silano vertiendo 50 microlitros de T-C-P-F-O-S puro en un portaobjetos de vidrio.

Coloque el portaobjetos dentro de un desecador e incube durante dos horas. Haga P-D-M-S en un vaso de plástico mezclando la base de elastómero con el agente de curado y revuelva constantemente durante tres minutos. Desgasifique la mezcla P-D-M-S en un desecador durante 30 minutos para eliminar todas las burbujas de aire.

Coloque las obleas de silicio de la capa de control en una placa de Petri y vierta una capa de mezcla P-D-M-S de cinco milímetros de espesor sobre las piezas de silicio. Después del proceso de vertido P-D-M-S, repita la desgasificación de la mezcla P-D-M-S. Coloque la oblea de silicio con una capa de flujo frente al camión hilandero aplicando una presión de vacío de 200 a 500 militorr.

Vierta aproximadamente un mililitro de P-D-M-S en la oblea de silicio. Codifique usando un recubridor de centrifugado para obtener una capa de aproximadamente 80 micrómetros de espesor. Hornea las dos obleas de silicio con el P-D-M-S recubierto de centrifugado y vierte las capas de P-D-M-S a 50 grados centígrados en un horno de convección de aire caliente durante seis horas.

Después de enfriar, las piezas cortan la capa P-D-M-S de cinco milímetros de espesor de la pieza de silicio alrededor de la capa de control con una cuchilla afilada y la despegan del sustrato de silicio. Perfore dos orificios de aproximadamente un milímetro de diámetro utilizando una perforadora Harris en el depósito del bloque P-D-M-S para conectar el canal de inmovilización y las entradas del canal de aislamiento a las líneas de gas para las deflexiones de membrana P-D-M-S. Coloque la pieza de silicona con la capa P-D-M-S recubierta de espín en el patrón uno con la superficie recubierta de P-D-M-S hacia arriba en una bandeja de plástico.

Mantenga el bloque P-D-M-S perforado con el patrón dos en la bandeja con el lado moldeado hacia arriba. Mantenga la bandeja de plástico dentro de un limpiador de plasma y exponga las dos superficies P-D-M-S a plasma de aire de 18 vatios durante dos minutos aplicando vacío bajo. Saque los dos bloques tratados con plasma y una suavemente los bloques presionando las superficies tratadas con plasma de los patrones uno y dos.

Hornea los patrones unidos a 50 grados centígrados durante dos horas en un horno de convección de aire caliente. Después de sacar el dispositivo unido del horno, córtelo de la oblea de silicio con el patrón uno y el patrón dos y perfore los orificios en los depósitos de entrada y salida de la capa de flujo con el perforador Harris. Coloque el bloque P-D-M-S unido con la capa de flujo hacia arriba en una bandeja de plástico y mantenga un vidrio de cubierta limpio en la misma bandeja.

Exponga los bloques en el vidrio de la cubierta a plasma de aire de 18 vatios durante dos minutos. Ajuste la presión del vacío para ver una cámara violeta. Coloque el bloque P-D-M-S expuesto con plasma en el vidrio de la cubierta y hornee la estructura unida en un horno a 50 grados centígrados durante dos horas.

Guarde el dispositivo en una cámara limpia para cualquier experimento futuro. Tome el dispositivo, colóquelo en un microscopio estéreo y conecte los tubos. Conecte un tubo microflex a una línea de gas nitrógeno comprimido y un conector de tres vías en el otro extremo.

Conecte los tubos uno y dos de los conectores de tres vías a la trampa en membranas aislantes respectivamente. Conecte dos tubos microflex a los dos puertos de salida de la llave de paso de tres vías. Conecte el otro extremo de los dos tubos a una aguja de calibre 18 de ocho milímetros de largo.

Llene la capa de flujo con tampón M-9 utilizando una micropipeta a través del puerto de entrada. Llene ambos tubos con agua desionizada a través del extremo conectado a la aguja. Inserte las dos agujas en los orificios perforados que conectan la membrana aislante y atrapante.

Abra el regulador de gas nitrógeno a 14 P-S-I y gire la válvula de tres vías del tubo uno para empujar el agua hacia el dispositivo a través de los canales microfluídicos en las capas de control, es decir, las membranas de trampa y aislamiento. Libere la presión usando la llave de paso de tres vías, una vez que los canales estén llenos de agua y cebados. Retire las burbujas haciendo fluir medios adicionales a través del canal de flujo.

La figura muestra imágenes de P-S-3-2-3-9, animal creciendo dentro del chip microfluídico e inmovilizado cada ocho a 10 horas para capturar imágenes de fluorescencia. La variación en el patrón de expresión representa un ejemplo de regulación temporal de genes donde el mismo gen se expresa en diferentes células en diferentes etapas de desarrollo. Las imágenes del genotipo individual W-D-I-S-5-1 de caenorhabditis elegans muestran una arquitectura dendrítica ramificada similar a la menorá en cada neurona P-V-D que comprende procesos primarios, terciarios secundarios y cuaternarios en las etapas de desarrollo L-2, L-2 tardía, L-3 y L-4, respectivamente.

La figura en este documento compara el desarrollo de P-V-D y los animales cultivados en dispositivos, y los cultivados en placas N-G-M. El número de S-P y Q-P en diferentes etapas del desarrollo del gusano aumentó con la edad. Caenorhabditis elegans se trató con una caída de tres milimolares de levamisol para causar suficiente parálisis requerida para imágenes de alta resolución.

Los valores de S-P no fueron significativamente diferentes cuando se midieron de animales por etapas similares cultivados en placas N-G-M y se obtuvieron imágenes utilizando levamisol de tres milimolares en un portaobjetos de agar. Además, la distancia entre los dos cuerpos celulares P-V-C, uno presente en la cola y el segundo presente cerca de la vulva, aumenta a medida que se separan tanto en los animales cultivados en el dispositivo como en los que crecen en placas N-G-M. La figura representa la imagen de alta resolución de las neuronas receptoras táctiles de animales que crecen dentro del dispositivo microfluídico.

El montaje representa todo el proceso neuronal P-L-M-R en puntos de tiempo sucesivos destacando las mitocondrias y el proceso neuronal. El gráfico representa la longitud total del proceso neuronal que se observó que aumentaba con una pendiente de 10,4 micrómetros por hora. El dispositivo microfabricado utiliza una membrana delgada P-D-M-S desviada en presencia de gas nitrógeno a alta presión para inmovilizar y mantener C-elegans en su lugar para obtener imágenes de alta resolución.

Este procedimiento puede permitir estudios longitudinales de procesos celulares y subcelulares en C-elegans que necesitan observaciones intermitentes durante un largo período de tiempo.