Muestreo eficiente del espacio de diseño de biosensores codificados genéticamente habilitado con un diseño de experimentos y flujo de trabajo de automatización

El desarrollo y la optimización de biosensores hacia aplicaciones biotecnológicas es el alcance de nuestra investigación. Específicamente, nuestro objetivo es comprender cómo optimizar y diseñar biosensores a través de la modulación de sus elementos genéticos. Las opciones de diseño impulsadas por la intuición, como la ingeniería de promotores clásica y la clasificación celular activada por fluorescencia, son técnicas que se aplican de forma rutinaria en la caracterización y el diseño de biosensores.

El diseño de metodologías experimentales aún no se ha adoptado ampliamente en el diseño de circuitos genéticos. A través de este protocolo, buscamos aumentar la adopción de este tipo de técnicas en el diseño de circuitos genéticos y biosensores. Para comenzar, determine el tamaño teórico de la biblioteca y calcule el número de variantes individuales necesarias para garantizar una cobertura superior al 95% de la biblioteca.

Calcule el volumen requerido de medios de caldo de lisogenia suplementados con antibióticos de acuerdo con el número de colonias que se van a analizar. Abra el software del manipulador de líquidos y haga clic en ejecutar junto al programa de transferencia de líquidos MTP. Coloque el medio preparado en la posición de depósito correspondiente.

A continuación, llene la plataforma con placas de microtitulación vacías según la disposición. Configure el programa para dispensar 200 microlitros de medios. Haga clic en Aceptar para confirmar el inicio del programa.

Ahora, transfiera los pocillos de placa de microtitulación llenos a una plataforma de selección de colonias y abra y transfiera placas de barrena cuadrada de Pseudomonas putida transformadas con ADN de biblioteca de variantes de plásmidos a la plataforma de selección de colonias. Use el selector de colonias para inocular cada pocillo precargado con una sola colonia de las placas transformadoras. Vuelva a sellar las placas inoculadas y transfiéralas a una incubadora de agitación fuera de línea.

Después de la incubación, devuelva las placas cultivadas a la plataforma del manipulador de líquidos y abra. Haga clic en ejecutar junto al protocolo Agregar glicerol a MTP. Asegúrese de que el diseño de la placa en la pantalla coincida con el del muelle del manipulador de líquidos.

Y secuencialmente, haga clic en Aceptar para que se ejecute el protocolo. Una vez terminado, selle las placas y mézclelas brevemente en una incubadora de agitación fuera de línea a 800 revoluciones por minuto durante cinco minutos. Codifique las placas con códigos de barras y guárdelas a 80 grados centígrados hasta que las necesite.

Calcule el volumen requerido de medios suplementados con antibióticos para bloques de pocillos profundos. Haga clic en ejecutar junto al programa de transferencia de líquidos DWB. Asegúrese de que el medio se agregue al depósito correcto.

Los bloques vacíos de pozos profundos están en las posiciones de diseño correctas y que se dispone de un suministro adecuado de puntas. Configure el programa para dispensar 495 microlitros de medios. Cuando esté listo, haga clic secuencialmente en Aceptar para iniciar el programa.

Ahora, selle los bloques llenos de pocillos profundos con membrana transpirable y transfiéralos al almacenamiento temporal a 4 grados centígrados. A continuación, haga clic en ejecutar junto al inoculado del programa MTP descongelado. Asegúrese de que las existencias criogénicas de MTP y los bloques de pocillos profundos de llenado se transfieran a la plataforma por diseño y que se carguen suficientes puntas.

Secuencialmente, haga clic en Aceptar para inicializar. Cuando finalice el programa, selle los bloques de pozos profundos inoculados durante la noche con una membrana transpirable. Transfiéralos a una incubadora agitadora de placas fuera de línea configurada durante 16 horas a 30 grados Celsius, 800 revoluciones por minuto y 75% de humedad.

Vuelva a sellar, mezclar y devolver las placas de microtitulación criogénicas al congelador a 80 grados Celsius. Ahora, calcule el volumen requerido de medios suplementados con varias concentraciones de efectores y antibióticos para los bloques de pocillos profundos durante la noche que se examinarán. Haga clic en ejecutar junto al programa de transferencia de líquidos DWB.

Luego, asegúrese de que los depósitos de medios suplementados con efectores estén colocados correctamente. Agregue bloques vacíos de pozos profundos a la plataforma del manipulador de líquidos. Cuando haya suficientes consejos disponibles, haga clic secuencialmente en Aceptar para iniciar el protocolo para generar bloques de pocillos profundos de ensayo.

Después del llenado, selle los bloques de pocillos profundos del ensayo con una membrana transpirable. Rellene el manipulador de líquidos con platos vacíos. Repita la inoculación hasta que se llenen todos los bloques de ensayo.

A continuación, haga clic en ejecutar junto al programa DWB de transferencia al ensayo. Después de colocar correctamente los bloques de pocillos profundos de ensayo sin sellar con medios suplementados con efectores, transfiera y desprecinta durante la noche los bloques de pocillos profundos que contengan P. putida cultivada por diseño. Haga clic secuencialmente en Aceptar para iniciar el protocolo.

Cuando el programa haya terminado, selle las placas de ensayo de transferencia a la incubadora fuera de línea. Deseche los bloques de pozos profundos durante la noche después de la inoculación. A continuación, transfiera los bloques de pocillos profundos a una centrífuga.

Celdas de pellets a 4.000 G en un rotor controlado por hielo a 18 grados Celsius durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, coloque los bloques de centrífuga en la plataforma del manipulador de líquidos. Calcule el volumen de una vez el PBS requerido en función del número de bloques de pozos profundos que se examinarán.

Haga clic en ejecutar junto al programa DWB de resuspensión de PBS configurado por ensayo y establezca el volumen de dispensación en 500 microlitros. Luego, asegúrese de que PBS se agregue al depósito correcto y coloque las placas centrifugadas de acuerdo con el diseño. Haga clic en Aceptar para iniciar el programa después de confirmar la disponibilidad de propinas.

Vuelva a sellar y retire los bloques de pocillos profundos resuspendidos del manipulador de líquidos. Revise la parte inferior de la placa para asegurarse de que los gránulos estén completamente resuspendidos. Haga clic en ejecutar junto a las celdas de configuración del ensayo y el programa MTP de la edición PBS.

Luego, transfiera los bloques de pozos profundos resuspendidos al manipulador de líquidos de acuerdo con el diseño. Cargue las placas de microtitulación vacías de acuerdo con el diseño y establezca el volumen de dispensación en 200 microlitros antes de hacer clic en Aceptar. Transfiera las placas de microtitulación llenas a un lector de placas multimodo fuera de línea y mida la fluorescencia relativa y OD600.

La selección automatizada de 5.000 variantes promotoras identificó a los principales candidatos que mostraban una activación superior a 3,6 veces. Se trazaron los valores de EC 50 para 100 variantes únicas para visualizar la distribución de sensibilidad e identificar candidatos robustos. Los valores de EC 50 se calcularon para 226 variantes enriquecidas y se clasificaron mediante la transformación Lin-log para formar una biblioteca con escala de sensibilidad.

Se construyó un diseño de cribado definitivo utilizando una varianza de nivel 1, 0 y 1 de cuatro módulos. Los perfiles del modelo de transporte, regulador, salida P y sitio de unión al ribosoma de salida revelaron cómo los cambios en los niveles de expresión de los cuatro módulos afectaron de forma no lineal a EC 50 y al coeficiente de Hill. Identificación de combinaciones de expresión óptimas con RBS-Out, mostrando un fuerte efecto positivo tanto en la sensibilidad como en la pendiente.

La variante de biosensor optimizada globalmente que incorpora fortalezas ideales del módulo demostró una sensibilidad mejorada y un coeficiente de Hill en comparación con las versiones parentales y DSD optimizadas.