Name: Caracterización de Sistemas Complejos Uso del Diseño de Experimentos Enfoque: Expresión de Proteínas transitoria en tabaco como un estudio de caso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 24 s
Description: Aprende a optimizar la expresión transitoria de proteínas en hojas de tabaco mediante diseño de experimentos. Este método permite identificar parámetros clave y mejorar la producción de anticuerpos monoclonales en plantas.

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Los autores agradecen al Dr. Thomas Rademacher para proporcionar el vector de expresión de planta ppam e Ibrahim Al Amedi para el cultivo de las plantas de tabaco utilizadas en este estudio. Nos gustaría dar las gracias al doctor Richard M. Twyman por su ayuda con la edición del manuscrito. Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el Advanced Grant &quot;Future-Pharma&quot; Consejo Europeo de Investigación, la propuesta número 269.110 y la Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fundación Fraunhofer Futuro).

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La tasa de publicación fue parcialmente patrocinado por las empresas Statease, Inc. (EE.UU.) y STATCON (Alemania), que no participaron en los involucrados en la preparación del manuscrito o responsable de cualquiera de sus contenidos.

Cada experimento requiere una planificación cuidadosa, porque los recursos suelen ser escasos y caros. Esto es particularmente cierto para las estrategias del Departamento de energía debido a errores durante la fase de planificación (por ejemplo, la selección de un modelo base que no cubra todas las interacciones significativas factores) pueden disminuir sustancialmente la capacidad predictiva de los modelos resultantes y así devaluar todo el experimento. Sin embargo, estos errores se pueden evitar fácilmente s...

La producción de proteínas biofarmacéuticas en las plantas es ventajoso porque las plantas son de bajo costo para crecer, la plataforma puede ser ampliado con sólo crece más plantas, y los patógenos humanos son incapaces de replicarse 1,2. Las estrategias de expresión transitoria basados ​​por ejemplo en la infiltración de las hojas con Agrobacterium tumefaciens proporciona beneficios adicionales ya que el tiempo entre el punto de entrega de ADN y la entrega de un producto purificado se reduce de año a menos de 2 meses 3. La expresión transitoria también se utiliza para el análisis funcional, por ejemplo, para probar los genes por su capacidad para complementar mutantes de pérdida de función o para investigar las interacciones de proteínas 4-6. Sin embargo, los niveles de expresión transitoria tienden a mostrar una mayor variación de lote a lote de los niveles de expresión en plantas transgénicas 7-9. Esto reduce la probabilidad de que los procesos de fabricación biofarmacéutica basan en wi expresión transitoriall ser aprobado en el marco de las buenas prácticas de fabricación (GMP), ya que la reproducibilidad es un atributo crítico calidad y está sujeta a la evaluación de riesgos 10. Esta variación también puede enmascarar cualquier interacción que los investigadores tienen la intención de investigar. Por lo tanto, nos propusimos identificar los principales factores que afectan los niveles de expresión transitoria en plantas y construir un modelo de predicción cuantitativa de alta calidad. El enfoque de un factor-en-un-tiempo (OFAT) se utiliza a menudo para caracterizar el impacto (efecto) de ciertos parámetros (factores) sobre el resultado (respuesta) de un experimento 11. Pero esto no es óptima debido a que las pruebas individuales (corre) durante una investigación (experimento) estarán alineados como perlas en una cuerda a través del área potencial abarcado por los factores que se evalúan (espacio de diseño). La cobertura del espacio de diseño y por lo tanto el grado de información derivada de la experimento esbajo, como se muestra en la Figura 1A 12. Además, las interdependencias entre los diferentes factores (interacciones de factores) pueden permanecer ocultos que resulta en modelos pobres y / o la predicción de falsa Optima, como se muestra en la Figura 1B 13. Los inconvenientes descritos anteriormente se pueden evitar mediante el uso de un diseño de experimentos de aproximación (DoE) en la que se ejecuta de un experimento se dispersan de manera más uniforme en todo el espacio de diseño, lo que significa que más de un factor se varía entre dos carreras 14. Hay diseños especializados para las mezclas, los factores (diseños factoriales) y la cuantificación de los impactos de los factores sobre las respuestas (métodos de superficie de respuesta, RSM s) 15 de detección. Además, RSM se pueden realizar como diseños-compuesto central, pero también se puede lograr de manera efectiva mediante el uso de software especializado que puede aplicar diferentes criterios para la selección de carreras. Por ejemplo, el llamado D-optimalitcriterio y seleccionará carreras a fin de minimizar el error en los coeficientes del modelo resultante, mientras que el criterio IV-optimalidad selecciona carreras que logran la varianza de predicción más bajo en todo el espacio de diseño 15,16. El RSM como se describe aquí permite la cuantificación precisa de la expresión de proteína transitoria en plantas, pero que puede ser fácilmente transferido a cualquier sistema que implica varios (~ 5-8) factores numéricos (por ejemplo, temperatura, tiempo, concentración) y unos pocos (~ 2 - 4) factores categóricas (por ejemplo, promotor, color) en el que una descripción mecanicista no está disponible o demasiado complejo para modelar. El enfoque DoE se originó en las ciencias agrícolas, pero se ha extendido a otras áreas, ya que es transferible a cualquier situación en la que es útil para reducir el número de ciclos necesarios para obtener datos fiables y generar modelos descriptivos de procesos complejos. Esto a su vez ha dado lugar a la inclusión del DoE en la &quot;Guía para laIndustria, Q8 (R2) Desarrollo Farmacéutico &quot;, publicado por la Conferencia Internacional sobre Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos para Uso Humano (ICH) 17. DoE ahora se utiliza ampliamente en la investigación científica y la industria 18. Sin embargo, se debe tener cuidado durante la planificación y ejecución del experimento, porque la selección de un grado del polinomio impropio para el modelo de regresión lineal múltiple (modelo base) pueden presentar una necesidad de tiradas adicionales para modelar los efectos de los factores correctamente. Además, dañados o datos faltantes generan modelos incorrectos y defectuoso predicciones, y puede incluso prevenir cualquier intento de construcción de modelos, como se describe en el protocolo y de discusión de los artículos 18. En la sección de protocolo, que inicialmente se establecerán los pasos de planificación más importantes para un experimento basado en la RSM y luego explicar el diseño basado en el DoE software v8.1 DesignExpert. Pero diseños similares se pueden construir con otros includi softwareng JMP, Modde y STATISTICA. Los procedimientos experimentales son seguidos por instrucciones para el análisis y evaluación de datos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1.jpg" /> Figura 1. Comparativa de. OFAT y DoE A. Variación secuencial de un factor a la vez (OFAT) en un experimento (círculos negros, rojos y azules) logra una baja cobertura del diseño de espacio (regiones sombreadas). Por el contrario, la variación de más de un factor a la vez usando el diseño de experimentos de estrategia (DoE) (círculos verdes) mejora la cobertura y por lo tanto la precisión de los modelos resultantes. B. La cobertura de espacio de diseño sesgada significa que los experimentos OFAT (círculos negros) también pueden fallar para identificar regiones óptimas de operación (rojo) y predecir soluciones sub-óptimas (gran círculo negro), mientras que el DoE strategies (estrellas negras) son más propensos a identificar condiciones preferentes (gran estrella negro).

<table><tbody><tr><td>Experto-en Diseño(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td> <td>software</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8952.2</td><td>Componente de medio</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2363.2</td><td>Componente de medio</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Componente de medio</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K029.2</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5210.2</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Escherichia coli K12 DH5a</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td>Microorganismo</td></tr><tr><td>pPAM</td><td>GenBank</td><td>AY027531</td><td>Clonación/vector de expresión; &nbsp;</td></tr><tr><td>Plásmido NucleoSpin &nbsp;</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740588.250</td><td>Kit de aislamiento de ADN plasmídico</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel y limpieza de PCR</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740609.250</td><td>Kit de purificación de ADN plasmídico</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>n.a.Espectrofotómetro</td><td></td></tr> <tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193L</td><td>Restricciónendonucleasa</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs Inc.</td><td>R3101L</td><td>Restricciónendonucleasa</td></tr><tr><td>AscI</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td>Restricciónendonucleasa</td></tr><tr><td>NEB 4</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs Inc.</td><td>B7004S</td><td>Restriccióntampón endonucleasa</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Tetraborato de disodio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4403.3</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>EDTA Carl</td><td>Roth GmbH</td><td>8040.2</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6352.4</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A512.1</td><td>Indicador de color</td></tr><tr><td>Xileno cianol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A513.1</td><td>Indicador de color</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>7530.2</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>BioRad</td><td>170-4406</td><td>Cámara de electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101:pMP90RK</td><td>DSMZ</td><td>12365</td><td>Microorganismo</td></tr><tr><td>Electroporador 2510</td><td>Eppendorf</td><td>4307000.658</td><td>Electroporador</td></tr><tr><td>Extracto de carne de vacuno</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X975.2</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2365.2</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0261.3</td><td>Componente multimedia</td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6344.2</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T832.3</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico Rifampicina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4163.2</td><td>Imprimación antibiótica</td></tr><tr><td>FWD</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCT</td> <td>CAG GAA GAG CAA</td></tr><tr><td>TAC REV</td><td>primer Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCA</td> <td>AAG CGA GTA CAC AAC</td></tr><tr><td>2720 Termociclador</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359659</td><td>Termociclador</td></tr><tr><td>Servidor web RNAfold</td><td>Universidad de Viena</td><td>n.a.Software</td><td></td></tr> <tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Fertilizante</td></tr><tr><td>Grodan Cubos de lana de roca 10 x10 cm</td><td>Grodan</td><td>n.a.Bloque</td> de <td>lana de roca</td></tr><tr><td>Invernadero</td><td>n.a.n.a.Para</td><td></td> <td>el cultivo</td></tr> <tr><td>de plantasPhytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.Para</td> <td>el cultivo de plantas</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo</td><td>B. Braun</td><td></td><td>6064204 Jeringa</td></tr><tr><td>Murashige y sales de Skoog</td><td>Duchefa</td><td>M 0222.0010</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.2</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Acetosiriringa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Análogo</td></tr> <tr><td>de fitohormonas&nbsp; BioPhotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td>6132 000.008</td><td>Fotómetro</td></tr><tr><td>Osram blanco frío 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Fuente de luz</td></tr><tr><td>Fosfato disódico</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4984.3</td><td>Centrífuga de componentes medios</td></tr><tr><td>5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>Forma -86C Ultracongelador</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ThermoFisher 88400Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Lector de placas de fluorescencia</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>n.a.SPR</td><td></td></tr> <tr><td>dispositivo Protein A</td><td>Life Technologies</td><td>10-1006 Proteína de</td><td>unión a anticuerpos</td></tr><tr><td>HEPES Carl Roth</td><td>GmbH</td><td>9105.3</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Anticuerpo 2G12</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>Anticuerpo de referencia</td></tr></tbody></table>

caracterización de sistemas complejos uso del diseño de experimentos enfoque: expresión de proteínas transitoria en tabaco como un estudio de caso

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Las plantas proporcionan múltiples beneficios para la producción de productos biofarmacéuticos incluyendo bajos costos, escalabilidad y seguridad. La expresión transitoria ofrece la ventaja adicional de desarrollo a corto y tiempos de producción, pero los niveles de expresión puede variar significativamente entre los lotes, dando así lugar a preocupaciones de reglamentación en el contexto de las buenas prácticas de fabricación. Se utilizó un diseño de enfoque experimentos (DoE) para determinar el impacto de los factores más importantes, como elementos reguladores en la construcción de expresión, crecimiento de las plantas y de los parámetros de desarrollo y las condiciones de incubación durante la expresión, en la variabilidad de la expresión entre lotes. Hemos probado plantas que expresan un anticuerpo monoclonal anti-VIH modelo (2G12) y una proteína marcadora fluorescente (DsRed). Se discute la justificación de la selección de ciertas propiedades del modelo e identificar sus posibles limitaciones. El enfoque general puede ser fácilmente transferido a otros problemas debido a que los principios del modelo de unre ampliamente aplicable: selección de parámetros basada en el conocimiento, la reducción de la complejidad mediante la división del problema inicial en módulos más pequeños, la instalación del software guiado de las combinaciones óptimas de experimentos y el aumento de diseño por etapas. Por lo tanto, la metodología no sólo es útil para la caracterización de la expresión de proteínas en las plantas, sino también para la investigación de otros sistemas complejos que carecen de una descripción mecanicista. Las ecuaciones de predicción que describen la interconectividad entre los parámetros pueden ser utilizados para establecer modelos mecánicos para otros sistemas complejos.

Un modelo descriptivo para la acumulación de DsRed durante la expresión transitoria utilizando diferentes promotores y 5&#39;UTRs DsRed de fluorescencia en los extractos de hoja se utiliza para indicar el nivel de expresión de la proteína recombinante y de este modo se utilizó como la respuesta en la estrategia DoE. La diferencia mínima detectable consideramos relevante fue de 20 mg / ml y la desviación estándar estimada del sistema fue de 8 mg / ml en base a los experimento...

Se describe un diseño de enfoque experimentos que se puede utilizar para determinar y modelar la influencia de los elementos reguladores de transgenes, los parámetros de crecimiento y desarrollo de la planta, y las condiciones de incubación en la expresión transitoria de los anticuerpos monoclonales y proteínas reportero en plantas.

Caracterización de Sistemas Complejos Uso del Diseño de Experimentos Enfoque: Expresión de Proteínas transitoria en tabaco como un estudio de caso

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

El objetivo general del siguiente experimento es generar modelos predictivos para la expresión transitoria de proteínas en las hojas de las plantas. Esto se logra mediante el establecimiento de un diseño experimental para identificar los parámetros más importantes para la expresión transitoria y cuantificar su impacto en la acumulación de proteínas. Como segundo paso, los genes se clonan y se transfieren a las agrobacterias, que luego se inyectan en las hojas, lo que da lugar a una expresión transitoria de proteínas.A continuación, se analizan muestras de hojas para determinar los niveles de expresión de proteínas. Se obtienen resultados que muestran el patrón de niveles transitorios de expresión de proteínas en hojas de diferentes edades y para diferentes condiciones de incubación a partir de un diseño de evaluación de modelos experimentales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como un factor a la vez, es que se pueden detectar y cuantificar las interacciones entre diferentes parámetros, como la edad de la hoja o la posición de la hoja.El enfoque de un factor a la vez que se utiliza a menudo para caracterizar el efecto de ciertos factores en el resul

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Rufián, J. S., et al. Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae en el tejido vegetal. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demuestra un método para analizar la expresión génica en bacterias patógenas extraídas de plantas a nivel unicelular utilizando un factor de transcripción marcado con fluorescencia. La imagen confocal revela heterogeneidad en la expresión génica de virulencia, destacando la diversidad funcional dentro de una población bacteriana clonal.

Análisis de una sola célula de la expresión génica de patógenos extraídos por plantas

Las plantas ofrecen un sistema novedoso para la producción de proteínas farmacéuticas a escala comercial que es más escalable, rentable y seguro de expresión paradigmas actuales. En este estudio, se presenta un enfoque simple y conveniente, y escalable para introducir meta-gen que...

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Las plantas de tabaco se usaron para producir una celulasa fúngica, TrCel5A, a través de un sistema de expresión transitorio. La expresión podría ser monitoreado usando una proteína de fusión fluorescente, y la actividad de la proteína se caracterizó después de la expresión.

Expresión recombinante de celulasa de Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; En plantas de tabaco

En este estudio se comparó la expresión de una proteína recombinante humana diana en diferentes plataformas de producción. Nos centramos en los cultivos tradicionales basados en fermentadores y en las plantas, describiendo la configuración de cada sistema y destacando, sobre la base de los resultados informados, los límites y ventajas inherentes a cada plataforma.

Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems

A nivel subcelular, los eventos de señalización son modulados dinámicamente por señales de desarrollo y ambientales. Aquí describimos un protocolo que emplea el sistema de expresión transitoria del tabaco para monitorear la interacción dinámica proteína-proteína y para revelar la organización espacial de la transducción de señales en células vegetales.

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en las hojas de Nicotiana benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno. Es en este documento se describe un protocolo detallado para rápido (5 días) escala de preparativo de triterpenos y análogos utilizando esta potente plataforma basada en plantas.

Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

Aprende a optimizar la expresión transitoria de proteínas en hojas de tabaco mediante diseño de experimentos. Este método permite identificar parámetros clave y mejorar la producción de anticuerpos monoclonales en plantas.

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Caracterización de Sistemas Complejos Uso del Diseño de Experimentos Enfoque: Expresión de Proteínas transitoria en tabaco como un estudio de caso

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