Caracterización de Sistemas Complejos Uso del Diseño de Experimentos Enfoque: Expresión de Proteínas transitoria en tabaco como un estudio de caso

El objetivo general del siguiente experimento es generar modelos predictivos para la expresión transitoria de proteínas en las hojas de las plantas. Esto se logra mediante el establecimiento de un diseño experimental para identificar los parámetros más importantes para la expresión transitoria y cuantificar su impacto en la acumulación de proteínas. Como segundo paso, los genes se clonan y se transfieren a las agrobacterias, que luego se inyectan en las hojas, lo que da lugar a una expresión transitoria de proteínas.

A continuación, se analizan muestras de hojas para determinar los niveles de expresión de proteínas. Se obtienen resultados que muestran el patrón de niveles transitorios de expresión de proteínas en hojas de diferentes edades y para diferentes condiciones de incubación a partir de un diseño de evaluación de modelos experimentales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como un factor a la vez, es que se pueden detectar y cuantificar las interacciones entre diferentes parámetros, como la edad de la hoja o la posición de la hoja.

El enfoque de un factor a la vez que se utiliza a menudo para caracterizar el efecto de ciertos factores en el resultado de un experimento es subóptimo porque las carreras individuales durante un experimento se alinearán como perlas en una cuerda, logrando así una baja cobertura del espacio de diseño. A diferencia del diseño de experimentos de la estrategia DOE, la variación de más de un factor a la vez mejora la cobertura y, por lo tanto, la precisión de los modelos resultantes. Además, la cobertura sesgada del espacio de diseño en un factor a la vez.

Los experimentos también pueden fallar en identificar regiones operativas óptimas y predecir soluciones subóptimas, mientras que las estrategias de DOE son más propensas a identificar condiciones preferibles. Este diagrama de flujo ilustra el proceso de planificación de una estrategia de DOE. El primer paso es identificar los factores y respuestas relevantes para su inclusión en el diseño.

En esta demostración, se medirán los niveles de expresión de un modelo de anticuerpo monoclonal contra el VIH dos G 12 y un marcador fluorescente, la proteína DS rojo, sobre la base de experimentos anteriores. La diferencia mínima detectable que se considere pertinente será de 10 microgramos por mililitro para dos G 12 y de 20 microgramos por mililitro para el DS rojo. Además, los valores aproximados de la desviación estándar estimada del sistema para dos G 12 y DS rojo serán de cuatro y ocho microgramos por mililitro respectivamente.

Los pasos restantes para planificar esta estrategia del DOE no se discutirán aquí, pero los detalles se pueden encontrar en el manuscrito adjunto. Dos G 12 y DS rojo se expresarán transitoriamente en las plantas de tabaco. Para comenzar el procedimiento para el cultivo de plantas, prepare bloques de pared de roca de 10 por 10 por ocho centímetros rociándolos ampliamente con agua desionizada para eliminar los productos químicos residuales.

Después de eso, equilibre los bloques con una solución recién preparada de semillas de fertilizante plantas de tabaco colocando una o dos semillas de tabaco en cada bloque de pared de roca, seguido de un breve lavado con fertilizante. Tenga cuidado de evitar lavar las semillas, germine y cultive las plantas de tabaco durante 42 días en un invernadero en condiciones adecuadas. Prepare el AUM FASS cultivando un cultivo hasta un diámetro exterior de 600 nanómetros de 5,0.

Diluya el cultivo con agua y doble medio de infiltración para que coincida con el diámetro exterior de 600 nanómetros requerido para la inyección antes de la inyección. Confirme el diámetro exterior de 600 nanómetros del atum de la suspensión de fasion para preparar las hojas para la inyección. Rasque suavemente la epidermis en el lugar de la inyección con la punta de una pipeta para facilitar la entrada de la solución AUM Fasion.

Evite romper la lámina de la hoja mientras lo hace. Sostenga la jeringa que contiene la suspensión de fasión AUM perpendicular a la hoja de la hoja, tocando el cilindro contra el campo intercostal a tratar, empuje suavemente la salida hacia la parte inferior de la hoja. Al mismo tiempo, presione suavemente la parte superior de la hoja para evitar que la lámina de la hoja se mueva o se rompa.

Empuje suavemente hacia abajo el pistón de la jeringa. La solución de moda AUM ingresará a los espacios intercelulares dentro de la lámina de la hoja, como lo indican las áreas tratadas que aparecen más oscuras, verdes y húmedas. Asegúrese de que la jeringa permanezca perpendicular a la hoja durante la inyección.

De lo contrario, la suspensión bacteriana puede ser estimulada bajo alta presión. Repita este procedimiento en varias posiciones hasta que todo el campo intercostal esté infiltrado con aum, aum, fass. Luego continúe con el siguiente campo intercostal después de la inyección, incube las plantas en las condiciones determinadas por el DOE cuando se complete el período de incubación.

Comience el muestreo. Estabilice la hoja con una toalla de papel de mano y use un préstamo de corcho para eliminar cuatro o cinco discos de hojas de los campos intercostales tratados en las posiciones y momentos indicados por el DOE. No retire toda la hoja de la planta durante el muestreo.

Determine la masa de cada muestra y colóquela en un tubo de reacción de plástico de 1,5 mililitros etiquetado con el nombre y la masa de la muestra. Almacene las muestras a 20 grados centígrados bajo cero o 80 grados centígrados bajo cero antes de la cuantificación de proteínas. El proceso puede detenerse en esta etapa durante varios meses, dependiendo de la estabilidad de la muestra y la temperatura de almacenamiento para extraer proteínas de las muestras de disco de hojas.

Agregue tres mililitros de tampón de extracción por miligramo de masa de muestra y muela los discos de hojas en el tubo de reacción con un mortero eléctrico hasta que no queden fragmentos grandes. Para evitar el sobrecalentamiento de la muestra, coloque el tubo sobre hielo siempre que el tubo se sienta caliente después de la centrifugación. Para eliminar los sólidos dispersos, transfiera el sobrenadante a un tubo de reacción limpio de 1,5 milímetros.

Mida la fluorescencia roja DS dos veces secuencialmente. En un lector de 96 cilindros equipado con 530 filtros de excitación de 25 nanómetros y 590 filtros de emisión de 35 nanómetros para cada muestra. Promedie la fluorescencia en las dos lecturas y las tres réplicas técnicas y reste el valor registrado para el control en blanco que contiene cero microgramos por mililitro DS rojo.

También reste este valor de las lengüetas de las diluciones estándar y use estos valores corregidos en blanco para una regresión lineal que produce una curva de referencia. A continuación, la pendiente de la curva de referencia se utiliza para convertir la fluorescencia medida para las muestras en concentraciones de rojo DS. El procedimiento para determinar la concentración de los dos anticuerpos G 12 no se mostrará aquí, pero se detalla en el manuscrito adjunto.

El software Design Expert se utiliza para el análisis y la evaluación de datos en el nodo de análisis. Elija la respuesta que se va a analizar e inicialmente seleccione Ninguna en la pestaña de transformación. Continúe con la pestaña Resumen de ajuste, que proporciona información general sobre los factores que son importantes para el sistema que se está investigando.

El software sugerirá un modelo inicial en función de su importancia en la pestaña del modelo. Se preselecciona un modelo inicial en función de los resultados del resumen de ajuste. Utilice el modo automatizado para editar este modelo en la pestaña Innova.

Investigue el modelo sugerido y los factores incluidos si es necesario. Elimine manualmente cualquier factor con valores P por encima de un umbral predefinido o aquellos que sean poco probables en función de consideraciones mecanicistas volviendo a la pestaña del modelo, cambiando la selección a manual y eliminando los factores apropiados del modelo. Continúe con la pestaña de diagnóstico para confirmar la calidad del modelo y detectar posibles valores atípicos en el conjunto de datos que tengan una fuerte influencia en el modelo.

Al examinar todas las pestañas de la herramienta de diagnóstico, ajuste el tipo de transformación en la pestaña correspondiente si así lo sugiere el cuadro Diagrama de Cox y reinicie el procedimiento de análisis en la pestaña Gráficos del modelo. Visualice el modelo evaluado para un número limitado de factores numéricos, como tres. La representación de la superficie de respuesta es útil para evaluar las características óptimas.

Las superficies de respuesta manual solo ilustran el impacto de dos factores en la respuesta que se está investigando. El efecto de cualquier factor adicional en la respuesta se revela cambiando su valor o nivel en la ventana de herramientas de factores. Alternativamente, los factores se pueden asignar al eje de la gráfica haciendo clic con el botón derecho en ellos en la ventana de herramientas de factores y seleccionando el eje de variables independientes deseado.

Manipule los niveles de los factores y asígnelos a las coordenadas del gráfico con la herramienta de factores. Exporte gráficos usando el comando exportar gráfico a archivo en la pestaña de archivo. Utilice el subnodo numérico en el nodo de optimización para optimizar numéricamente la respuesta deseada, en función de los factores del modelo a los que, a su vez, se pueden aplicar ciertas restricciones a través de la pestaña de criterios.

Calcule y examine soluciones numéricas en la pestaña de soluciones en función de la entrada proporcionada en la pestaña de criterios. Exporte estas soluciones a otro software, como una hoja de cálculo, para un análisis más detallado que revele la configuración de los factores asociados con los valores de respuesta altos o bajos. Esto es útil si se investigan más de tres factores numéricos, y la representación en 3D es difícil en este estudio representativo.

Se utilizó la estrategia DOE para examinar los efectos de diferentes promotores y cinco RS principales sobre la expresión transitoria de ds. En esta tabla se muestran los factores rojos incluidos en el modelo de expresión transitoria y los rangos investigados. Los factores en negrita son exclusivos de este experimento.

Los factores en cursiva son para otro experimento que se describirá más adelante. Se seleccionaron al menos tres niveles para todos los factores numéricos discretos para permitir el cálculo de un modelo base cuadrático. Se eligió un algoritmo de selección óptimo para la selección de las corridas de DOE para obtener las estimaciones más precisas de los coeficientes del modelo de regresión.

El diseño sugerido inicialmente por el experto en diseño consistió en 90 corridas, pero el FDS fue insuficiente para lograr un error estándar de predicción del 1%. El aumento óptimo del diseño a un total de 210 corridas resolvió este problema y dio como resultado un FDS del 100% con una precisión de predicción más uniforme en todo el espacio de diseño indicado por la curva plana, las concentraciones de rojo DS se determinaron para las 210 corridas y los datos se transformaron en log 10. Los factores del modelo se eligieron mediante selección inversa automatizada de un modelo cúbico con un nivel alfa de 0,100.

Esto dio como resultado un modelo significativo con una falta de ajuste insignificante y valores altos para los coeficientes de correlación múltiples. El valor de P de todos los factores del modelo fue inferior a 0,05 y, por lo tanto, no se requirió una mayor manipulación manual del modelo. El modelo contenía interacciones de tres factores resaltadas en negrita que no formaban parte de la reevaluación inicial del modelo base cuadrático del gráfico FDS.

El uso de todos los factores incluidos en el modelo de predicción final reveló que el FDS para el error estándar de predicción no había disminuido significativamente al incluir las interacciones adicionales de tres factores. Las herramientas de diagnóstico de calidad del modelo en el experto en diseño indicaron que la transformación de datos fue útil y que no faltaron factores en el modelo porque el gráfico normal de residuos mostró un comportamiento lineal y no se observó un patrón específico en el gráfico de residuos frente al predicho. Tampoco hubo tendencia a lo largo del experimento a indicar una variable oculta dependiente del tiempo.

En cambio, las predicciones del modelo estaban en muy buen acuerdo con la fluorescencia roja de Díaz observada, ya que todos los puntos se encuentran cerca de la diagonal. Por lo tanto, se asumió que el modelo seleccionado era útil para predecir la expresión transitoria de rojo DS en hojas de tabaco no leadinas derivadas de diferentes combinaciones de promotores cinco UTR principales durante un período de incubación posterior a la infiltración que duró ocho días, y también se seleccionó un modelo de regresión lineal artificial sin transformación de datos para ilustrar las consecuencias de una selección y transformación de factores incorrectas. Como se ve claramente aquí, el gráfico normal de residuos se desvía del comportamiento lineal esperado y hay un patrón en forma de V en el gráfico de residuos frente a uno predicho en lugar de una dispersión aleatoria.

Además, el gráfico de residuales frente a ejecución destaca dos valores extremos. Si bien las predicciones fueron deficientes tanto para los valores pequeños como para los altos que se desvían de la diagonal, aquí se muestran las superficies de respuesta óptimas del modelo para la expresión transitoria del rojo DS en las hojas de tabaco. El modelo predijo que la edad foliar fue un factor significativo con niveles de expresión más bajos en las hojas viejas, por ejemplo, la hoja dos en la parcela A y la parcela B en comparación con las hojas jóvenes como la hoja seis en la parcela C y la parcela D. La progresión de la acumulación de rojo DS en las hojas no fue lineal ni exponencial, sino que siguió una curva sigmoidal durante los ocho días de incubación post infiltración.

Las cinco combinaciones principales de UTR con el promotor CAMV 35 SS dieron lugar a una expresión más fuerte de rojo DS que las combinaciones con el promotor NOS. Aunque las cinco UTR principales también tuvieron un impacto significativo en la expresión de DS right, como lo muestra la comparación entre TL y CHS, la fuerza de expresión dependió del promotor acompañante. El modelo predictivo también indicó que ciertos pares de combinaciones de UTR promotor cinco principales, como nas CHS y CAMV 35 SS CHS, dieron lugar a niveles de expresión equilibrados que difieren en menos del 30% de una proporción definida en todas las hojas y tiempos de incubación superiores a dos días.

Esta expresión equilibrada sería útil para la expresión de proteínas multiméricas con una estequiometría definida. También se utilizó el enfoque DOE para optimizar las condiciones de incubación y los esquemas de cosecha para la producción simultánea de dos G 12 y DS rojos en tabaco. Los factores que afectan la expresión transitoria que se incluyeron en este experimento están en cursiva de 600 nanómetros y el tiempo de incubación.

Se estableció un modelo predictivo para la expresión de cada proteína en plantas a diferentes edades. Las hojas jóvenes se cosecharon a los 40 días después de la siembra, las hojas viejas se cosecharon a los 47 días después de la siembra. A continuación, se evaluaron estos cuatro modelos y se estableció un modelo de consenso que incluía cada uno de los factores considerados significativos en los modelos individuales.

Posteriormente se confirmó que el modelo de consenso seguía siendo una buena representación de todos los conjuntos de datos iniciales. Posteriormente, se utilizó el modelo de consenso para identificar las temperaturas óptimas de incubación y el diámetro exterior bacteriano de 600 nanómetros para ambas proteínas con el fin de predecir las concentraciones de proteínas en todas las hojas y las posiciones de las hojas en plantas jóvenes y viejas. La integración de los perfiles de concentración con los datos de biomasa dio como resultado un rendimiento absoluto de proteína.

A continuación, se correlacionaron las cantidades absolutas de proteína con los costes asociados aguas abajo, lo que permitió un análisis de coste-beneficio para el procesamiento de cada hoja por edad de la planta. La misma cantidad de rojo DS y aproximadamente el 65% de dos G 12 se encontró en las plantas jóvenes en comparación con las viejas, a pesar de una biomasa promedio aproximadamente un 50% más baja que refleja la mayor expresión de proteínas específicas en las plantas jóvenes. Esto reveló que las plantas jóvenes eran ventajosas para la expresión transitoria porque las proteínas alcanzaban concentraciones más altas durante períodos de crecimiento más cortos, a pesar de la menor biomasa general en comparación con las plantas viejas.

Por último, también se descubrió que procesar todas las hojas de las plantas viejas era más costoso que descartar las hojas de una a tres y aumentar el número de plantas por lote. Por lo tanto, los modelos basados en DOE son adecuados no solo para marcar el paso final de un experimento, sino también para combinarlos con otros datos para facilitar aspectos más complejos del análisis de procesos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar la conducta y analizar un DOE para investigar la expresión transitoria de proteínas en las plantas.