Modelado de la infección persistente por Pseudomonas aeruginosa en larvas de pez cebra heridas

Las infecciones crónicas causadas por la bacteria Pseudomonas aeruginosa son tolerantes a los antibióticos y muy difíciles de tratar. Nuestro objetivo es desarrollar un modelo in vivo que acelere el descubrimiento de terapias eficientes. Los medicamentos antibacterianos se examinan principalmente in vitro, y probar medicamentos en ratones con infección crónica es un desafío complejo. Para llenar el vacío entre estos dos enfoques, proponemos un modelo preclínico alternativo utilizando larvas de pez cebra heridas. Nuestro modelo de infección persistente en pez cebra basado en el uso de la cepa clínica de Pseudomonas aeruginosa reproduce la tolerancia a los antibióticos. Mientras que la microinyección se usa comúnmente para infectar larvas de pez cebra, nuestro método de herida refleja un modo de infección natural y es muy adecuado para la detección de compuestos terapéuticos.

[Narrador] Para comenzar, coloque agujas de calibre 25 encima de dos palillos para facilitar el manejo. Con un microscopio estereoscópico, identifique y extraiga los embriones que muestran un desarrollo anormal o que no son viables. Mueva el plato con movimientos circulares para reunir los embriones restantes en el centro. Ahora, use dos agujas orientadas verticalmente para aislar cada embrión, colocando la aguja izquierda en la cola para mantener el cuerpo recto. Con la aguja derecha, haz un solo corte en el borde de la notocorda para quitar la aleta. Complete cada corte rápidamente, asegurándose de que todos los embriones estén sumergidos en una solución bacteriana en 10 minutos. Para el procedimiento de infección, agite la solución de Pseudomonas aeruginosa bajo una cabina de seguridad biológica tipo dos y agréguela aproximadamente uno por 10 a la potencia de siete unidades formadoras de colonias por mililitro en una placa de seis pocillos. Utilice una pipeta Pasteur de vidrio desechable para recoger los embriones heridos y transferirlos a la solución bacteriana. Incube la placa de seis pocillos a 28 grados centígrados durante 1,5 horas. Después de la incubación, recupere los embriones infectados y colóquelos bajo la seguridad microbiológica para su lavado. Ahora, transfiera los embriones con una pipeta de vidrio a 10 mililitros de agua de pescado sin azul de metileno, minimizando el volumen transferido e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera los embriones nuevamente con una pipeta de vidrio a cuatro mililitros de agua de pescado sin azul de metileno e incube brevemente. A continuación, con una pipeta, transfiera los embriones infectados individualmente a una placa de 24 pocillos, agregando un mililitro de agua de pescado sin azul de metileno a cada pocillo. Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora a 28 grados centígrados. Prepare tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros con 95 microlitros de 1X PBS para cada larva infectada. Transfiera las larvas a una placa de seis pocillos que contenga cuatro mililitros de agua de pescado sin azul de metileno para lavar y eliminar las bacterias planctónicas. Coloque cada embrión lavado en un tubo de microcentrífuga con PBS, transfiriendo la menor cantidad de líquido posible. Ahora, use un mortero para aplastar cada embrión contra el costado del tubo de microcentrífuga, dejando el mortero dentro del tubo después. Luego, levante el mortero y agregue 100 microlitros de PBS Triton al 2% para enjuagar las bacterias residuales del mortero, logrando una concentración final del 1%. Agite el tubo e incube durante 10 minutos. A continuación, dispense tres gotas de 10 microlitros de lisado sin diluir de cada embrión en placas de agar LB. Utilice una pipeta multicanal para diluir en serie cada lisado en una placa de 96 pocillos hasta un 10 a la potencia de menos tres diluciones. Finalmente, dispense tres gotas de 10 microlitros de las diluciones junto a los puntos sin diluir. E incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Los cuatro aislamientos de fibrosis quística de Pseudomonas aeruginosa fueron significativamente menos virulentos en el modelo de embrión lesionado en comparación con la cepa de referencia PAO1. En los embriones infectados con dos aislamientos, la carga bacteriana se redujo notablemente durante tres días, lo que indica la eliminación bacteriana. Por el contrario, los otros dos aislados, B6513 y RP73, mantuvieron una carga bacteriana relativamente estable de 18 a 65 horas después de la infección después de una caída inicial, lo que sugiere persistencia. Un tratamiento corto de 30 minutos con tobramicina a las 1,5 horas después de la infección redujo drásticamente la carga bacteriana en embriones infectados con aislados B6513. La tobramicina no tuvo un efecto significativo sobre la carga bacteriana cuando se administró a las 24 o 48 horas después de la infección, lo que demuestra resistencia durante las etapas de infección persistente.