Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

El objetivo general del siguiente experimento es etiquetar las proteínas de interés con fosfatos radiactivos con el fin de cuantificar las proteínas, los niveles de fosforilación celular. Esto se logra mediante el cultivo de células en presencia de fósforo 32 para marcar radiactivamente las modificaciones de fosfato de las proteínas expresadas en las células. Como segundo paso, las células marcadas se lisan y los lisados se incuban con perlas de afinidad para la inmunopurificación de las proteínas a analizar.

A continuación, las muestras de proteínas marcadas y purificadas se analizan con sulfato de sodio, electroforesis en gel de poliacrilamida y se mezclan en membranas de fluoruro de poliolaína. Con el fin de detectar la incorporación de fosfato radiactivo y los niveles de proteínas, se obtienen resultados que muestran que las quinasas repetidas ricas en leucina uno y dos, abreviadas L rrk one y L rrk dos se fosforilan en las células a niveles comparables basados en la autorradiografía y la inmunodetección. Una de las principales ventajas de la técnica de marcaje metabólico en comparación con otras técnicas como el fosfo, la inmunotransferencia, es que esta técnica permite determinar los niveles de fosforilación celular total de las proteínas, incluso para las proteínas para las que no se dispone de anticuerpos contra el fosfo.

La segunda gran ventaja de esta técnica es que se pueden realizar comparaciones cuantitativas entre diferentes proteínas en sus niveles de fosforilación celular total. Para demostrar el procedimiento, F gao, un técnico de nuestro laboratorio Para comenzar el cultivo de líneas de células T HEC 2 93 de acuerdo con condiciones de cultivo estándar en dcos modificado águila, medio o DMM con 8% de ternero fetal, suero y gentamicina. Expanda la placa y exprese la proteína L rrk dos marcada con triple bandera a través de la transfección o la transducción mediada por vectores lentivirales, como se discutió en el protocolo de texto.

Cuando las celdas estén confluentes entre un 80 y un 100%, enjuáguelas con dmm precalentado sin fosfato. Bajo un flujo laminar, prepare un tubo de halcón con 2,1 mililitros de MS libre de fosfato por m por placa de seis pocillos de células para ser marcado con fósforo. 32 ortofosfato.

Prepare el banco en el que se realizarán los experimentos con radiación ionizante. El espacio de trabajo está cubierto por una estera antiderrames sobre la que se coloca un revestimiento protector de material absorbente. También proporcione un frasco de metacrilato en el espacio de trabajo y coloque el tubo de medio libre de fosfato en el interior.

Retire del refrigerador el recipiente forrado con plomo con el vial de ortofosfato marcado con fósforo 32 y llévelo al banco de radiactividad. Monitoree el recipiente para detectar contaminación radiactiva externa con un contador Geiger: diluya el ortofosfato marcado con fósforo 32 en el tubo de dmem sin fosfato. Añadir una concentración de 24 micro curies por mililitro.

Mantenga el tubo en el frasco de metacrilato. Cierre el recipiente con el resto del ortofosfato marcado con fósforo 32 antes de devolverlo al refrigerador. A continuación, retire de la incubadora las seis placas de pocillos con las células que se van a etiquetar y colóquelas en el banco de radiactividad.

Retire el sobrenadante medio y deséchelo. A continuación, añada dos mililitros del medio libre de fosfato que contiene fósforo. 32 ortofosfato marcados por pocillo.

Coloque las placas de cultivo en una caja de metacrilato y luego monitoree el recipiente para detectar contaminación radiactiva externa con un contador Geiger. A continuación, transfiera la caja de metacrilato con células a una incubadora de células eucariotas dedicada al marcaje metabólico isotópico e incube las células durante una a 20 horas. En este punto del protocolo, las células se pueden tratar con compuesto si se desea, como se indica en el protocolo de texto. Después del tratamiento celular y la incubación, retire el medio de las células y deséchelo en un tubo de recolección de desechos que se coloca en el frasco de metacrilato.

Enjuague las células dos veces con dos mililitros de solución salina tamponada tris helada. Desechar la solución de enjuague en el tubo de recolección de residuos. A continuación, añada 0,5 mililitros de tampón de lisis por inmunoprecipitación helada a cada pocillo y recoja el lisado pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Para aflojar todas las células lisadas, transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga e incube en hielo al menos 10 minutos antes de la centrifusión como se indica en el protocolo de texto para aislar la proteína de interés mediante inmunopurificación. Primero, transfiera los tubos de microcentrífuga con lisados de centrífuga nuevamente al hielo. A continuación, pipetear el sobrenadante en tubos de microcentrífuga que contienen un lecho de 10 microlitros Volumen de la bandera M de dos velocidades aro.

Equilibrado como se discute en el protocolo de texto, transfiera los tubos de microcentrífuga a un tubo de 50 mililitros. Después de transferir los tubos de microcentrífuga a tubos de 50 mililitros marcados en hielo, coloque las muestras en un dispositivo giratorio detrás de un escudo de metacrilato en el área designada de una cámara frigorífica para mezclar de extremo a extremo a cuatro grados Celsius durante una a 20 horas después de la incubación, gire la bandera M unida a proteínas dos perlas aro en tubos de microcentrífuga después de desechar el sobrenadante en un tubo de recolección de desechos. Proceda a lavar las cuentas como se discutió en el protocolo de texto.

A continuación, vuelva a suspender las perlas lavadas en 40 microlitros de tampón de carga SDS de muestra IP Caliente las muestras en el tampón de carga a 95 grados centígrados durante dos minutos antes de centrifugar durante un minuto a más de 1000 veces g para pellet las perlas prepare el módulo de electroforesis en gel de proteínas en el banco de radiactividad detrás de una pantalla de perspec. Cargue las muestras en geles de página SDS de acetato tris de tres a 8%T, incluido un marcador de peso molecular que es adecuado para discernir tamaños de proteínas de alto peso molecular antes de realizar la electroforesis. Después de la electroforesis, retire el gel de su carcasa de plástico y transfiéralo a un recipiente con tampón de transferencia Western bloting.

Después de la preparación del gel y la membrana de PVDF. Prepare el sándwich secante en la superficie del módulo secante semiseco como se describe en el protocolo de texto. Transfiera las proteínas a 15 voltios durante una o dos horas después de la transferencia.

Retire la membrana de PVDF con proteínas agotadas del módulo de transferencia y seque la membrana para realizar una autorradiografía. Primero, exponga la membrana a una placa de fosforescencia durante uno a cinco días. Lea el fósforo 32 de la placa de fosforescencia expuesta utilizando un escáner de fosforescencia y guarde la imagen como un tiff de alta resolución para detectar los niveles de proteínas mediante inmunodetección.

Rehidrate las membranas sumergiéndolas brevemente en metanol y luego transfiriéndolas a un recipiente de incubación blott poco profundo con PBS. Bloquee las membranas en PBST que contienen 5% de leche. Incubar las manchas con anticuerpo anti LR K dos o anticuerpo anti-Flag y procesar posteriormente con los pasos de lavado adecuados y la incubación secundaria de anticuerpos.

Después de la aplicación de anticuerpos, realice la detección de quimioluminiscencia para confirmar los niveles relativos de proteínas de LRRK dos. Finalmente, la cuantificación de la corporación de fósforo 32 en LRK dos mediante análisis diamétrico como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestran resultados representativos para el marcaje metabólico de L Rrk uno y L Rrk dos en células T HEC 2 93. Aquí se muestra un auto-radiograma representativo de la incorporación de fósforo 32, así como una mancha occidental representativa de la detección de L Rrk uno y L Rrk dos a través de sus etiquetas de triple bandera.

Se observa la incorporación de fosfato radiactivo tanto para L rrk uno como para L rrk dos. Tras la cuantificación de los niveles de fósforo 32, se normalizaron a los niveles de proteínas medidos por el análisis métrico de densidad de la inmunodetección con el anticuerpo Anti-Flag. Se encontró que L rrk uno tiene un nivel de fosforilación promedio que es menor que L rrk dos en las condiciones probadas, aunque no se alcanza la significación estadística, No olvide que el trabajo con radiactividad puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como el equipo de protección personal y el trabajo a través de los procedimientos proporcionados por el departamento de seguridad de su institución siempre deben tomarse mediante la realización de este protocolo.