Name: Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende a cuantificar la fosforilación celular total de LRRK1 y LRRK2 mediante marcaje metabólico con fosfato radiactivo. Este método permite estudiar quinasas sin anticuerpos fosfo-específicos.

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También damos las gracias a la Fundación Michael J. Fox apoyar este estudio. Agradecemos a la Fundación de Investigación - Flandes FWO (proyecto FWO G.0666.09, senior comunión investigador a JMT), el proyecto Neuro-META TVN SBO/80020, la Universidad Católica de Lovaina (OT/08/052A y IOF-KP/07 / 001) por su apoyo. Esta investigación también fue financiada en parte por el Fondo Druwe-Eerdekens gestionados por la Fundación Rey Balduino a JMT.

<ol><li>Hanafusa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine-rich+repeat+kinase+LRRK1+regulates+endosomal+trafficking+of+the+EGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor.</a> Nat Commun. 2, 158(2011).</li>
<li>Titz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+signaling+network+of+the+BCR-ABL1+oncogene+shows+a+modular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization.</a> Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).</li>
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<li>Taymans, J. M., Cookson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dominant+parkinsonism%3B+the+toxic+triangle+of+LRRK2%2C+alpha-synuclein+and+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau.</a> Bioessays. 32, 227-235 (2010).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol Cell. 101, 183-191 (2009).</li>
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<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson+disease+gene+LRRK2%3A+evolutionary+and+structural+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Evol%22%5BJournal%5D)">The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights.</a> Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+origin+of+the+Parkinson+disease+gene+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2.</a> J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).</li>
<li>Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2%3A+from+kinase+to+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate.</a> Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).</li>
<li>Gloeckner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+Analysis+Reveals+Two+Discrete+Clusters+of+Phosphorylation+in+the+N-Terminus+and+the+Roc+Domain+of+the+Parkinson-Disease+Associated+Protein+Kinase+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2.</a> J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson%27s+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li>
<li>Greggio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2%2Fdardarin+associated+with+Parkinson+disease+are+more+toxic+than+equivalent+mutations+in+the+homologous+kinase+LRRK1%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1.</a> J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).</li>
<li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li>
<li>Daniëls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li>
<li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472(2012).</li>
<li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16(2010).</li>
<li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li>
<li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.Mol.Genet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

Este documento proporciona un protocolo básico para el ensayo de nivel de fosforilación general de LRRK1 y LRRK2 en líneas celulares mediante marcaje metabólico con 32P-ortofosfato. La estrategia general es sencillo. Etiquetados por afinidad proteínas LRRK se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene 32 P-ortofosfato. El P-32-ortofosfato es asimilado por las células después de sólo unas pocas horas de incubación y todas las moléculas en la célula que contienen...

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son paralogs multidominio que comparten un dominio organización similar. Ambas proteínas codifican una secuencia de GTPasa similar a la familia Ras de GTPasas (RAS de Proteínas del Complejo, o ROC), así como un C-terminal de dominio ROC (CDR), la clasificación de manera efectiva ambas proteínas a la familia de proteínas ROCO 5,6. N-terminal del dominio tándem ROC-COR, ambas proteínas codifican un dominio de repetición rica en leucina, así como un dominio de ankyrin como, mientras que sólo el LRRK2 codifica un armadillo adicional domein 6-8. C-terminal de la República de China-COR, ambas proteínas comparten un dominio quinasa serina-treonina, mientras que sólo LRRK2 codifica un dominio WD40 en la región C-terminal 8. Las funciones celulares precisas de LRRK1 y LRRK2 aún no se han dilucidado, sin embargo LRRK1 ha sido implicado en la señalización del receptor de tirosina quinasa de 1,2, mientras que la evidencia genética puntos a un papel para LRRK2 en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson 3,4. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; La fosforilación de proteínas es un mecanismo regulador común en las células. Por ejemplo, la fosforilación puede ser esencial para la activación de enzimas o para el reclutamiento de proteínas a un complejo de señalización. La fosforilación celular de LRRK2 ha sido caracterizado extensivamente y mapeo phosphosite ha mostrado una mayoría de los sitios de fosforilación celular tiene lugar en un clúster entre la repetición de anquirina y ricas en leucina repetir dominios 9-11. Aunque LRRK1 sitios de fosforilación celular aún no se han asignado, la evidencia de los estudios que utilizaron tinción fosfoproteína de manchas de proteína LRRK1 inmunoprecipitada a partir de células COS 7 sugiere que la proteína está fosforilada LRRK1 en las células 12. Este documento proporciona un protocolo básico para el ensayo de nivel de fosforilación general de LRRK1 y LRRK2 en líneas celulares mediante marcaje metabólico con 32P-ortofosfato. La estrategia general es sencillo. Affinity etiquetada LRRK proteins se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene 32 P-ortofosfato. El P-32-ortofosfato es asimilado por las células después de sólo unas pocas horas de incubación y todas las moléculas en la célula que contienen fosfatos, por lo tanto marcado radiactivamente. La etiqueta de afinidad (3xFLAG) se utiliza a continuación para aislar las proteínas LRRK de otros componentes celulares por inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados se separan luego a través de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y análisis de los fosfatos incorporados se realiza por autorradiografía (32 señal P) y de detección de Western (señal de proteína) de las proteínas en las manchas.

<table><tbody><tr><td>Radionúclido de fósforo-32, 1 mCi, tampón fosfato disódico en 1 ml de agua</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), líquido (alta glucosa)</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>Este medio no contiene fosfatos</td></tr><tr><td>Anti Flag M2 affiinty gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Para un producto equivalente con gel de color rojo (útil para visualizar más fácilmente las perlas), use cat. No. F2426.</td></tr><tr><td>Filtro secante extra grueso</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solución</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con radioactive fosfato

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son paralogs que comparten un dominio organización similar, incluyendo un dominio quinasa serina-treonina, un dominio de Ras proteínas complejas (ROC), un C-terminal de dominio de la República de China (COR), y rica en leucina y repite-anquirina como en el extremo N-terminal. Las funciones celulares precisas de LRRK1 y LRRK2 aún no se han dilucidado, sin embargo LRRK1 ha sido implicado en la señalización del receptor de tirosina quinasa de 1,2, mientras que LRRK2 está implicada en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson 3,4. En este informe, se presenta un protocolo para etiquetar las proteínas LRRK1 y LRRK2 en células con 32P-ortofosfato, proporcionando así un medio para medir los niveles generales de fosforilación de estas 2 proteínas en las células. En breve, la afinidad de las proteínas etiquetadas con LRRK se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene 32 P-ortofosfato. El P-32-ortofosfato es asimilado por las células después de sólo unos pocoshoras de incubación y todas las moléculas en la celda que contiene fosfatos de ese modo se marcaron radiactivamente. A través de la etiqueta de afinidad (3xFLAG) las proteínas LRRK están aislados de otros componentes celulares por inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados se separan luego a través de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y análisis de los fosfatos incorporados se realiza por autorradiografía (32 señal P) y de detección de Western (señal de proteína) de las proteínas en las manchas. El protocolo puede ser fácilmente adaptado para controlar la fosforilación de cualquier otra proteína que se puede expresar en las células y se aisló por inmunoprecipitación.

<html> Con el fin de comparar los niveles generales de fosforilación de LRRK1 y LRRK2 en las células, 3xFLAG etiquetada LRRK1 y LRRK2 se expresaron en células HEK293T 15. Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos y se marcaron con 32P y se analizaron como se ha descrito anteriormente en el texto del protocolo. Figura 1 muestra los resultados representativos para el etiquetado metabólico de LRRK1 y LRRK2 en células HEK293T. Incorporación de fosfato radiactivo se observa tanto...

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son proteínas multidominio que codifican tanto GTPasa y dominios quinasa y que son fosforilados en las células. Aquí, se presenta un protocolo para etiquetar LRRK1 y LRRK2 en las células con 32 P ortofosfato, proporcionando así un medio para medir sus niveles generales de fosforilación celular.

Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

El objetivo general del siguiente experimento es etiquetar las proteínas de interés con fosfatos radiactivos con el fin de cuantificar las proteínas, los niveles de fosforilación celular. Esto se logra mediante el cultivo de células en presencia de fósforo 32 para marcar radiactivamente las modificaciones de fosfato de las proteínas expresadas en las células. Como segundo paso, las células marcadas se lisan y los lisados se incuban con perlas de afinidad para la inmunopurificación de las proteínas a analizar.A continuación, las muestras de proteínas marcadas y purificadas se analizan con sulfato de sodio, electroforesis en gel de poliacrilamida y se mezclan en membranas de fluoruro de poliolaína. Con el fin de detectar la incorporación de fosfato radiactivo y los niveles de proteínas, se obtienen resultados que muestran que las quinasas repetidas ricas en leucina uno y dos, abreviadas L rrk one y L rrk dos se fosforilan en las células a niveles comparables basados en la autorradiografía y la inmunodetección. Una de las principales ventajas de la técnica de marcaje metabólico en comparación con otras técnicas como el fosfo, la inmunotransferencia, es que esta técnica permite determi

metabolic-labeling-leucine-rich-repeat-kinases-1-2-with-radioactive

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Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 es una quinasa multidominio grandes, las mutaciones en el que son la causa genética más común de enfermedad de Parkinson. Análisis de la actividad quinasa de la proteína ha demostrado ser una herramienta crucial en la comprensión de la biología y la disfunción de esta proteína. En este...

Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro</em

13 C-etiquetado de isótopos es una técnica útil para determinar el metabolismo de la célula central para varios tipos de microorganismos. Después las células han sido cultivadas con un sustrato marcado, GC-MS medición puede revelar las vías metabólicas funcional basada en los patrones de etiquetado único en proteinogenic aminoácidos.

Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

Fosfoinosítidos están señalando los lípidos cuya abundancia relativa cambia rápidamente en respuesta a diversos estímulos. Este artículo describe un método para medir la abundancia de fosfoinosítidos por las células metabólicamente etiquetado con 3 H- myo -inositol, seguido por extracción y desacilación. Glicero-inositides extraídos se separan luego por cromatografía líquida de alta resolución y cuantificados por centelleo de flujo.

El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

Describimos aquí un método para identificar múltiples fosforilaciones de una proteína intrínsecamente desordenada mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), utilizando la proteína Tau como caso de estudio. La Tau recombinante se enriquece isotópicamente y se modifica in vitro mediante una quinasa antes de la adquisición y el análisis de datos.

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Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

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Caracterizamos una nueva proteína quinasa utilizando enfoques bioquímicos robustos: análisis de Western Blot con un anticuerpo específico específico específico específico en diferentes líneas y tejidos celulares, interacciones por experimentos de coinmunoprecipitación, actividad quinasa detectada por Western Blot usando un anticuerpo fosfo-específico y por el etiquetado ATP de32P.

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Este protocolo describe un ensayo no radioactivo para medir la actividad quinasa de las quinasas de polinucleótidos (PNK) en sustratos pequeños de ADN y ARN.

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Este video muestra las técnicas para el etiquetado de las células madre embrionarias y células madre mesenquimales con tintes fluorescentes. Esta técnica se puede utilizar para un seguimiento in vivo de las células madre trasplantadas con técnicas de imagen óptico y de las correlaciones histopatológico con microscopía de fluorescencia.

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Aprende a cuantificar la fosforilación celular total de LRRK1 y LRRK2 mediante marcaje metabólico con fosfato radiactivo. Este método permite estudiar quinasas sin anticuerpos fosfo-específicos.

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