Tecnología de clasificación de células tumorales circulantes de alto rendimiento basada en microfluidos y secuenciación de células individuales

Nos centramos en desarrollar métodos de aislamiento y análisis de CTC de alto rendimiento para avanzar en la oncología de precisión mediante biopsia líquida. Las plataformas comerciales actuales de aislamiento CTC tienen bajo rendimiento y eficiencia. También son incompatibles con las plataformas de análisis posteriores, lo que limita la recuperación de información biológica.

Este estudio utiliza una plataforma de aislamiento microfluídico de CTC para mejorar considerablemente las tasas de detección. También aplicamos un chip de secuenciación de célula única de célula rara para un análisis más profundo de biopsias líquidas. Para empezar, una pipeta de 25 microlitros de estreptavidina lavada y resuspendida modificó las perlas magnéticas en un tubo que contenía un microgramo de anticuerpo EpCAM biotinilado.

Incuba la mezcla a temperatura ambiente mientras giras a 20 revoluciones por minuto durante 40 minutos para preparar las perlas inmunomagnéticas. Usando un soporte magnético, separa las cuentas del sobrenadante. Tras retirar el sobrenadante, resuspende las perlas en 25 microlitros de buffer de aislamiento.

Pipete 20 microlitros de la suspensión de la perla magnética en uno a dos segundos, asegurando que no se introduzcan burbujas de aire. Coloca inmediatamente la astilla verticalmente sobre un imán y deja que las cuentas se asienten durante cinco minutos sin molestar. Recoge cuatro mililitros de la muestra de sangre en una jeringuilla, asegurando que se eliminen las burbujas de aire.

Sella la entrada y salida del chip con líquido para eliminar las burbujas de aire, luego inserta los tubos de entrada y salida de la muestra dentro del chip. Utilizando una bomba de jeringuilla, inyecta la muestra a un caudal de 1,5 mililitros por hora. Tras cargar la muestra, inyectar 60 microlitros de DPBS en el chip HB a un caudal de 0,2 mililitros por hora para eliminar las células no unidas.

Retira el imán e inyecta manualmente 1,5 mililitros de 5%BSA para lavar el chip y liberar las células tumorales capturadas. Prepara una solución al 10% de MPTS en etanol. Introduce inmediatamente 20 microlitros de la solución en el chip HB e incuba a temperatura ambiente durante una hora.

Enjuaga la astilla de HB una vez con etanol anhidro y luego sécala a 100 grados Celsius durante una hora. A continuación, preparar la solución GMBS en etanol a una concentración de 0,5 miligramos por mililitro. Tras enfriar el chip a 37 grados Celsius, introduce la solución GMBS e incuba.

Enjuaga la astilla de HB dos veces con agua destilada doble, seguida de dos enjuagues con DPBS. Inmediatamente añade 15 microgramos por mililitro de estreptavidina al chip de HB e incuba a temperatura ambiente durante una hora o durante toda la noche a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, enjuaga el chip de HB dos veces con solución salina de DPBS.

Ahora prepara el tampón de anticuerpos CD45 añadiendo 0,2% de BSA y 20 microgramos por mililitro de anticuerpo biotinilado CD45 a DPBS y ajusta hasta el volumen final. Inyectar 20 microlitros del buffer de anticuerpos CD45 en el chip HB para la selección negativa de glóbulos blancos. Tras una incubación de una hora a temperatura ambiente, enjuaga el chip con DPBS.

Añade una solución bloqueante que contenga 3% BSA y 0,05% Tween 20 al chip HB. Aspira la muestra preparada en una jeringuilla, asegurándote de que no haya burbujas de aire. Luego sella la entrada y salida del chip con líquido y conecta los tubos de entrada y salida al chip.

Utilizando una bomba de jeringuilla, inyecta la muestra a un caudal de 0,6 mililitros por hora. Recoger células tumorales purificadas de la salida del chip para contar y secuenciar células individuales. Pipetear 200 microlitros de solución al 0,5% F-68 preparados en DPBS en la entrada del chip.

Realiza la sonicación en baño maria mientras sostienes el chip. Cuando las burbujas sean visibles en toda la región microporosa, continúa la sonicación durante 30 segundos para eliminar burbujas de los pozos dobles. A continuación, inyecta 200 microlitros de suspensión de células tumorales en el chip que contiene 60.000 pozos dobles.

Haz una pipete suave de la suspensión de la célula en la astilla dos veces. Luego vuelve a colocarla en una coctelera descoloridora durante cinco minutos para volver a suspender las células no capturadas y permitir que se asienten de nuevo. Ahora añade 200 microlitros de DPBS y solución 0,5%F-68 por la entrada y aspira desde la salida.

Tras volver a suspender la suspensión con talón con código de barras, inyecta inmediatamente 200 microlitros de suspensión en la entrada del chip y agita a 10 revoluciones por minuto durante 20 segundos. Haz una pipeta suave en la suspensión de cuentas dos veces antes de volver a colocarla en el shaker. Ahora retira la suspensión de esferas con código de barras de la salida, luego pipetea 200 microlitros de 20X Tris-EDTA y 50 milimolares ditiotreitol en solución.

Retira líquido de la salida. Para la lisis celular y la captura de ARN, añadir lentamente 200 microlitros de búfer de lisis celular en la entrada del chip. Añade inmediatamente 200 microlitros de aceite mineral para sellar los pozos dobles.

Elimina la solución que fluye desde la salida de la astilla hacia el depósito de residuos. Luego coloca la pastilla horizontalmente y déjala reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Añade lentamente 200 microlitros de solución 6X de citrato de sodio salino en la entrada.

Elimina el líquido residual y aspira la solución restante de la salida del chip. Añade poco a poco 200 microlitros de citrato de sodio 6X suero para llenar el chip. Coloca un imán cerca de la superficie del chip y muévelo lentamente de entrada a salida para recoger las cuentas con código de barras.

Aspira rápidamente la solución y se forma perlas en un tubo de centrífuga que contiene 6 veces suero de citrato de sodio. Lava las perlas con código de barras tres veces con 200 microlitros de citrato de sodio con suero salino 6X, seguido de una vez con buffer de transcripción inversa. Se observó una distribución uniforme de las perlas inmunomagnéticas bajo un campo magnético, mientras que las perlas residuales mínimas tras la extracción magnética confirmaron la liberación exitosa.

El chip de aislamiento CTC capturó eficazmente células tumorales tanto de muestras de 1 mililitro como de 10 mililitros. La adición del chip de purificación aumentó aún más la pureza de las células tumorales. En muestras de sangre periférica con un mínimo de células LNCaP, el sistema de clasificación CTC mantuvo una alta eficiencia y pureza de captura.

El chip de codificación de barras de una sola celda alcanzó una relación de ocupación de perlas con código de barras del 85,6% y del 95,7%, resultando en una tasa de emparejamiento del 81,9%. Aumentar el número de celdas cargadas mejoró la relación de ocupación de micropozos sin reducir la eficiencia de captura. El aislamiento integrado CTC y el flujo de trabajo de secuenciación de células individuales produjeron células tumorales altamente puras y mantuvieron con precisión las proporciones originales de células tumorales. El análisis TSNE separó claramente las células PC3, LNCaP y Jurkat en tres grupos, cada uno caracterizado por una expresión única de marcadores.

El grupo de células de Jurkat fue identificado por una fuerte expresión de TRBC1, IGLL1, CD1E y CD3D, confirmada por el enriquecimiento de vías para la activación de células T. Los clústeres PC3 y LNCaP se distinguieron por genes expresados diferencialmente, con PC3 mostrando alta expresión de microsemiproteicas y LNCaP expresando NEDD4.