Protocolo actualizado para el montaje y uso de la matriz de minibiorreactores (MBRA)

Por lo tanto, nuestra investigación se centra en el microbioma intestinal, específicamente en cómo se puede diseñar para prevenir la colonización de patógenos dañinos. Al mismo tiempo, también estamos interesados en comprender las reglas y mecanismos ecológicos detrás de esta resistencia a la colonización. La tecnología, como la secuenciación de próxima generación, la bioinformática avanzada, los ratones libres de gérmenes y los modelos intestinales in vitro, están transformando la forma en que estudiamos las comunidades microbianas y su papel en la salud y la enfermedad.

Uno de los mayores desafíos con los modelos intestinales in vitro es operarlos a un alto rendimiento. Lo que necesitamos son sistemas que permitan la interrogación funcional de las comunidades microbianas a escala. La matriz de minibiorreactores es un sistema de cultivo de flujo continuo que fue diseñado para abordar la falta de capacidad de rendimiento en otros sistemas.

Nos permite ampliar los experimentos sin dejar de capturar el comportamiento de la comunidad microbiana compleja y reproducible. Para comenzar, asegúrese de que las tiras de matriz de minibiorreactores estén impresas en 3D y contengan seis cámaras de biorreactores independientes. Organice todos los componentes necesarios para el montaje.

Usando un grifo de fracción 28 NF de 1/4 de pulgada con una llave de grifo con mango en T. Enrosque los tres puertos de 1/4 de pulgada en cada cámara para insertar los accesorios. Después de lavar la cámara con agua, coloque una barra de agitación magnética de 10 por 3 milímetros en cada cámara y agregue un mililitro de agua destilada.

Luego coloque una arandela de goma en la parte superior de cada puerto del biorreactor. Para cada cámara, atornille un señuelo macho roscado con pajita de medios, un señuelo macho roscado con pajita de desecho y un señuelo macho roscado vacío en los puertos. Ahora inserte seis septos de goma en las púas del señuelo hembra de 3/32 de pulgada y doble la manga superior de cada tabique hacia abajo para cubrir el cuello.

Conéctelos a los puertos designados de cada cámara. Corte tiras de tubería C-flex de la longitud y el número deseados. Conecte una lengüeta de señuelo hembra de 1/8 de pulgada a un extremo y un conector de bloqueo de señuelo macho al extremo opuesto de cada tramo de tubo.

Luego inserte una lengüeta de señuelo hembra de 1/16 de pulgada en cada extremo del tubo rojo de dos pasos de E-lab con un diámetro interior de 1,14 milímetros, y el tubo naranja de dos pasos de E-lab con un diámetro interior de 0,89 milímetros. Conecte el tubo de E-lab preparado al tubo C-flex y asegúrese de que cada una de las seis longitudes de tubo C-flex esté conectada a una línea de E-lab roja y otra naranja a través de señuelos hembra. A continuación, corte el tubo C-flex a diferentes longitudes según sea necesario.

Conecte una lengüeta de señuelo hembra de 1/8 de pulgada y un conector de bloqueo de señuelo macho a ambos extremos de una pieza de 3 pulgadas y la pieza de 12 pulgadas de tubo C-flex. Conecte conectores de bloqueo de señuelos macho a ambos extremos de las piezas restantes. Ensamble el árbol de líneas de residuos de acuerdo con el diagrama 3D.

Conecte los extremos expuestos del tubo rojo de dos paradas de E-lab a los bloqueos de señuelos macho terminales en el árbol de la línea de desagüe en orden ascendente según la longitud del tubo C-flex. Luego conecte el tubo C-flex de 3 pulgadas con la lengüeta del señuelo hembra de 1/8 de pulgada y el conector de bloqueo del señuelo macho a la parte superior del árbol de la línea de desecho. Ensamble el árbol de líneas de alimentación de acuerdo con el diagrama 3D.

Conecte los extremos expuestos del tubo naranja de dos paradas de E-lab a los bloqueos de señuelos macho terminales en el árbol de la línea de alimentación en orden ascendente según la longitud del tubo C-flex, y conecte el tubo C-flex de 12 pulgadas a la parte superior del árbol de la línea de alimentación. Conecte el tubo C-flex de longitud variable al final del árbol de línea de alimentación al biorreactor, disponiéndolos en orden ascendente desde la línea más corta a la izquierda hasta la más larga a la derecha. Conecte el tubo C-flex de longitud variable al final del árbol de la línea de desechos a la tira del biorreactor en orden descendente con la línea más larga a la izquierda y la más corta a la derecha para acomodar la colocación de la bomba.

Agrupe todas las líneas de alimentación C-flex juntas en el lado izquierdo de la tira y asegúrelas con una brida. Forme un bucle con el tubo naranja de E-lab de dos paradas entre las líneas C-flex y asegure el bucle con cinta de autoclave, y repita el proceso para la tubería roja de E-lab de dos paradas en el lado de desechos de la tira del biorreactor. Cubra el señuelo hembra al final de los desechos y alimente los árboles con papel de aluminio para evitar la contaminación.

Afloje los señuelos roscados macho con septos en cada cámara del biorreactor para permitir que el vapor escape durante el autoclave. Después de colocar el conjunto en un contenedor de autoclave, extienda los árboles de la línea de alimentación y desechos en contenedores separados adyacentes al que contiene las tiras MBRA. Para conectar el sistema a las bombas, retire la cinta de autoclave que sujeta la tubería del laboratorio electrónico para las líneas de desechos y alimentación, y desate los paquetes de tubería C-flex.

Coloque el MBRA entre las dos bombas en la parte superior de la placa de agitación. Sujételo con los soportes impresos en 3D y alinéelo con las posiciones de agitación marcadas en la placa. Ahora conecte el tubo de E-lab de la línea de alimentación a los cartuchos de la bomba peristáltica y coloque los topes de los tubos en las ranuras del cartucho.

Repita el proceso para el tubo E-lab de la línea de residuos en la bomba ubicada a la derecha de la placa de agitación. Luego bloquee los cartuchos de la bomba peristáltica en la bomba. Organice el tubo C-flex de forma ordenada utilizando los soportes de tubos impresos en 3D.

Conecte el extremo del árbol de la línea de residuos a la tubería conectada a las botellas de residuos. A continuación, conecte el señuelo hembra en el tubo de entrada de la línea de alimentación al conector macho en el tubo de 12 pulgadas desde la tapa de la botella de medios. Encienda ambas bombas para iniciar el flujo de medios y asegúrese de que ambas bombas estén configuradas en el sentido de las agujas del reloj cuando los desechos se coloquen a la derecha de las bombas.

Observe el tamaño y la cadencia de las gotas en cada cámara del biorreactor. Si se nota alguna variabilidad o anomalía, reemplace el tubo naranja de laboratorio electrónico de dos paradas conectado a la cámara afectada para reducir la variación del caudal. Una vez que las cámaras estén llenas, apague ambas bombas y deje reposar los biorreactores durante 24 a 48 horas para verificar si hay contaminación antes de comenzar el experimento.

Cambie la entrada de medios a un recipiente de un litro de lejía al 10% en agua desionizada y aumente el caudal en ambas bombas al máximo para desplazar el contenido de las cámaras del biorreactor con lejía. Una vez que las cámaras estén libres de medios, invierta el MBRA para desinfectar por encima de la línea de llenado durante cinco minutos. Después de cinco minutos, enderece el sistema y espere cinco minutos más para la esterilización.

Después de que las cámaras se hayan limpiado de medios y se hayan esterilizado durante 10 minutos, reemplace la lejía con un litro de agua desionizada y enjuague el sistema hasta que el agua haya pasado. Luego desconecte el tubo del laboratorio electrónico del biorreactor de las bombas y retire los MBRA. Retire los septos usados del biorreactor y drene cada cámara hasta que solo quede un mililitro de agua.

Reemplace los septos, el tubo naranja de laboratorio electrónico de dos paradas y autoclave la tira completamente ensamblada como se demostró anteriormente. Después de tres ciclos de reutilización, siga estos pasos. Se preparó una muestra fecal humana y se cultivó en el sistema MBRA.

Después de cuatro días de flujo continuo, la comunidad microbiana en los nueve biorreactores estaba dominada por 18 géneros bacterianos, cada uno de los cuales comprendía al menos el 2% de abundancia relativa en cualquier réplica. 22 de los 65 géneros detectados estaban presentes en las nueve réplicas de biorreactores, lo que demuestra una alta reproducibilidad. El análisis de diversidad alfa mostró una variación mínima entre las réplicas tanto en las unidades taxonómicas operativas observadas como en el índice de diversidad de Shannon.