Aislamiento eficiente de células madre y adipocitos derivados del adiposo a partir de tejido adiposo porcino

El propósito de esta investigación es aislar células del tejido adiposo de forma eficiente y rápida. La digestión tradicional implica un coste de tiempo y puede sobredigerirse. Nuestra medida enzimática y de ondas mecánicas ofrece una dispersión suave y reduce el tiempo de aislamiento.

Para empezar, coloca un trozo de tejido adiposo subcutáneo posterior de un cerdo eutanasiado en un plato de cultivo. Diseca a lo largo del plano natural entre el tejido adiposo y la dermis para obtener una lámina completa de ULB de dos a tres milímetros de grosor. Enjuaga el ULB una vez con solución fisiológica estéril helada.

Después de romper un plato de cultivo estéril, pesa el tejido en el recipiente estéril sobre una balanza preesterilizada. Por cada 1,8 gramos de tejido, añade 10 mililitros de tampón de D-Hank bien frío y mantén el tejido completamente sumergido. Utiliza tijeras quirúrgicas estériles para identificar y extirpar todos los vasos sanguíneos visibles del tejido.

Elimina cualquier tejido conectivo y componentes fibróticos. Desecha los materiales extirpados en contenedores designados como biohazard. Enjuaga el tejido dentro del tampón de D-Hank para eliminar la sangre y los restos residuales.

Pesa el tejido en la bandeja de cultivo estéril sobre una balanza preesterilizada después de romper la bola. Transfiere 1,8 gramos de los fragmentos de tejido de enjuague a un tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Añade 800 microlitros de buffer de disociación tisular tipo A al tubo.

Utiliza tijeras oftálmicas estériles para picar el tejido del tubo en piezas de aproximadamente uno a dos milímetros cúbicos de tamaño. Transfiere el tejido de carne picada junto con el buffer circundante a un nuevo tubo microcentrífuga. Añade 200 microlitros de agente disociador tisular tipo A al tubo.

Gira y agita suavemente el tubo con la mano tres veces para mezclar el contenido. Asegúrate de que los fragmentos adiposos estén completamente inmersos en la solución de disociación. Comprueba si la tapa del tubo está bien cerrada.

Coloque el tubo en un baño metálico a 37 grados Celsius e incube durante cinco a diez minutos. Transfiere el tejido adiposo parcialmente digerido en tampón a un tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros designado para el sistema de disociación mecánica. Ejecuta el programa preestablecido para tejido adiposo para realizar disociación mecánica usando una onda sinusoidal de 200 hertzios.

Recoge la suspensión de la celda y pásala por un colador de celda de 200 micrómetros hasta un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Añade cinco mililitros de solución de D-hank pre-enfriada a cuatro grados Celsius al colador. Enjuaga el colador dos veces con la solución D-Hank.

Centrifuga la suspensión de celda filtrada a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Utiliza una pipeta pasteur estéril para aspirar y eliminar la capa lipídica sobrenadante, dejando un mililitro de tampón para proteger la capa de adipocitos. Recoge la segunda capa que contiene los adipocitos sin alterar la tercera y cuarta capa.

Aspira y desecha la tercera capa. Añade un mililitro de buffer de D.Hank al pellet inferior que contiene la fracción vascular estromal, o SVF. Resuspende suavemente la pastilla celular en el tampón para lograr una concentración celular de dos a cinco veces diez a la potencia de seis células por mililitro.

Prepara la suspensión de la celda SVF en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Mantén la suspensión en hielo hasta que la uses. Añade 10 microlitros de suspensión de celda SVF y 10 microlitros de solución azul de tripán al 0,4% en un tubo microcentrífuga estéril de 0,5 mililitros.

Haz una pipete suave arriba y abajo tres veces. Transfiere 10 microlitros de la mezcla celular teñida a una lámina de conteo, adecuada para el contador automático de células. Verifica que la muestra llene completamente la cámara sin desbordarse.

Inserta la diapositiva de conteo en el contador automático de celdas. Selecciona el tipo de ensayo de trypan blue y ajusta el rango de concentración celular si es necesario. Pulsa conteo para iniciar el recuento automático de celdas.

Monitoriza las imágenes de la cámara de conteo y observa la distinción automática entre células vivas y muertas. Registra el porcentaje de viabilidad de las células y el número total de celdas viables que se muestran en la pantalla del instrumento. Realiza tres mediciones independientes para cada muestra.

Calcular la viabilidad media y el rendimiento celular por gramo de tejido adiposo. Prepara una solución de tinción con cinco microgramos por mililitro descascado y un micromolar BODIPY en D.Hank's. Incubar los adipocitos aislados en la solución de tinción durante 15 minutos a 37 grados Celsius.

Utiliza un sistema de tapa de vidrio adaptado para portaobjetos adaptado a los adipocitos para preparar las láminas, adecuado para microscopía de fluorescencia. El sistema de montaje casero compatible con adipocitos permitía una distribución uniforme de los adipocitos intactos para obtener imágenes claras. A diferencia de los métodos tradicionales que producían disposiciones apiñadas y multicapas, los adipocitos extraídos mostraban estructura intacta y morfología normal.

La tasa de supervivencia de los adipocitos obtenida mediante el método de disociación mecánica fue significativamente mayor en comparación con el método tradicional de hidrólisis enzimática. Las células madre derivadas del adiposo purificadas y cultivadas exhibieron una morfología uniforme similar a la de fibroblastos, con células alargadas en forma de huso dispuestas de forma ordenada. La mayoría de las células permanecieron sin teñir, lo que indica viabilidad, mientras que solo una pequeña proporción se teñió de azul, representando células muertas.

Este protocolo permite a los investigadores comparar los caracteres celulares aislados a través de depósitos de adiposos. Los SVF aislados del protocolo pueden utilizarse para la construcción de organoides y la purificación de células madre adiposas. Estudios futuros podrían optimizar aún más el método de aislamiento, considerando las variaciones del tejido adiposo en la matriz extracelular a través del depósito.