Tinción de proteínas en geles de

En un video anterior titulado Separación electroforética de proteínas, demostramos cómo una mezcla compleja de proteínas puede separarse mediante electroforesis en gel. En este video, le mostraremos cuatro métodos diferentes de tinción de geles para visualizar la ubicación de las proteínas en el gel. Hola, soy Sean Gallagher de UVP, trabajando con el Centro de Proteómica aquí en el Instituto Graduado KEG.

Hoy les mostraré varias técnicas para visualizar proteínas tras su separación mediante electroforesis. Esto incluye la tinción azul de Kamasi, citro naranja y citro rubí. Comencemos entonces con la tinción azul de Kamasi.

La detección de bandas proteicas en un gel mediante tinción con azul de Kamasi depende de la unión no específica de un colorante. En este caso, azul brillante de Kamasi G dos 50. En este método, las proteínas separadas en un gel de poliacrilamida se lavan utilizando agua de alta pureza.

La ubicación de las proteínas se detecta entonces mediante una tinción acuosa con azul de kamasi. El límite de detección es de 0,3 a un microgramo por banda de proteína. Para comenzar, utilice un gel de poliacrilamida en el que las proteínas hayan sido separadas mediante electroforesis.

Mientras agita lentamente, coloque el gel de poliacrilamida en un recipiente de plástico lleno con 300 mililitros de agua de alta pureza. Deje reposar durante cinco minutos. Deseche el agua y repita el proceso dos veces más después del tercer lavado.

Vierta el agua y cubra el gel con la solución de colorante azul Kamasi durante una hora, agitando suavemente. Después de una hora de tinción, deseche la solución de colorante. Enjuague brevemente el gel colocándolo en aproximadamente 200 mililitros de agua durante 30 minutos. En este punto, el gel puede almacenarse en agua para su posterior imagenología.

El gel también puede secarse en esta etapa para conservar un registro permanente del gel. Para ello, coloque el gel sobre dos hojas de papel filtro Watman de tres mm y cubra la parte superior con una envoltura de plástico. Luego, seque en un secador de geles convencional durante una a dos horas a aproximadamente 80 grados celsius.

Otro método de tinción de proteínas es la tinción con plata, que demostraremos a continuación. Aunque el método de tinción con azul de Kamasi es más sencillo y rápido, la tinción con plata es considerablemente más sensible, con un límite de detección de 0,3 nanogramos de albúmina sérica bovina (BSA). La detección de bandas proteicas en un gel mediante tinción con plata depende de la unión de la plata a diversos grupos químicos de la proteína.

El siguiente protocolo se basa en el kit de tinción con plata Silver Quest de in Vitrogen. El protocolo se deriva del protocolo de tinción rápida, que dura aproximadamente 30 minutos, y representa una de las muchas químicas basadas en kits utilizadas para la tinción con plata compatible con espectrometría de masas. En este caso, utilizaremos un gel mini precolado de in Vitrogen antes de iniciar la tinción con plata.

Asegúrese de usar guantes en todo momento para evitar la contaminación por huellas dactilares. Coloque el gel en una bandeja apta para microondas con 100 mililitros de agua grado reactivo. Enjuague brevemente y luego deseche el agua.

A continuación, agregue 100 mililitros de fijador, compuesto de etanol al 40%, ácido acético al 10% en agua de alta pureza, y trate en microondas durante 30 segundos. El proceso en microondas acorta los pasos de incubación necesarios al acelerar la unión y la tinción. En este momento, coloque el gel sobre un agitador y agite suavemente durante cinco minutos.

Después de cinco minutos, deseche el fijador, agregue 100 mililitros de etanol al 30% para lavar el gel, caliente en el microondas durante 30 segundos y luego coloque el gel en un agitador durante cinco minutos. Después de cinco minutos, deseche el etanol. Ahora agregue 100 mililitros del reactivo sensibilizante, caliente en el microondas durante 30 segundos y luego coloque en un agitador durante dos minutos.

Después de los dos minutos, deseche el reactivo sensibilizante. Añada 100 mililitros de agua grado reactivo, caliente en el microondas durante 30 segundos y coloque en un agitador durante dos minutos. Vierta y repita para un total de dos ciclos de lavado.

Ahora agregue 100 mililitros de solución de tinción, caliente en el microondas durante 30 segundos y agite lentamente durante cinco minutos. Transcurridos los cinco minutos, deseche la solución de tinción. Añada 100 mililitros de agua grado reactivo, omita el microondas y coloque directamente sobre un agitador durante 20 a 60 segundos.

Deseche el agua y agregue inmediatamente 100 mililitros de la solución reveladora y revele hasta que las bandas proteicas se vuelvan visibles. Con el fondo permaneciendo claro, esto tomará aproximadamente de cinco a 10 minutos. En este momento, agregue 10 mililitros de solución de paro al revelador para detener el revelado y obtener los mejores resultados.

Fotografíe el gel lo antes posible, ya que puede haber ligeras variaciones en la intensidad del color y aumentos en los elementos de fondo no específicos. Con el tiempo, el gel que observa contendrá proteínas residuales. Después del electroblotting, seque el gel para conservar un registro permanente o guárdelo en una bolsa de plástico sellable. A continuación, demostramos un método para teñir los geles con fluorescencia.

Los colorantes fluorescentes presentan varias ventajas frente a los tinciones tradicionales de proteínas. Las tinciones de geles de proteínas con naranja de cipro, que describiremos aquí, pueden detectar de uno a dos nanogramos de proteína por banda. Esto es más sensible que la tinción con azul brillante de kamasi y tan sensible como muchas técnicas de tinción argéntica.

La tinción fluorescente es sencilla, requiere menos manipulación que los protocolos típicos de tinción con plata y se completa en menos de una hora. Las proteínas teñidas pueden visualizarse utilizando un transiluminador estándar de 300 nanómetros de luz UV o un escáner láser. En este caso, nuevamente utilizaremos un gel mini precolado de in vitrogen para preparar y separar proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE.

Pero utilice SDS al 0,05 % en el tampón de marcha en lugar del SDS al 0,1 % habitual para reducir la fluorescencia de fondo. Para comenzar el procedimiento de tinción, vierta la solución de tinción fluorescente cipro en un recipiente de plástico pequeño para una o dos geles mini de tamaño estándar. Utilice aproximadamente 50 mililitros de solución de tinción.

Es importante tener en cuenta que los recipientes para tinción deben limpiarse y enjuagarse bien antes de usarlos, ya que cualquier detergente interferirá con la tinción. A continuación, coloque el gel en la solución de tinción. Cubra el recipiente con papel de aluminio para proteger el colorante de la luz intensa.

Agite suavemente el gel a temperatura ambiente durante 40 a 60 minutos. Deseche la solución de tinción y luego enjuague el gel durante menos de un minuto con ácido acético al 7,5%, aproximadamente 100 mililitros, para eliminar el exceso de colorante de la superficie del gel. Retenga el gel incubándolo durante toda la noche en tween 20 al 0,1% para visualizar y fotografiar las bandas proteicas. Coloque el gel marcado con fluorescencia directamente sobre un transiluminador estándar de 300 nanómetros o un transiluminador de luz azul.

A continuación, demostraremos un método alternativo de tinción fluorescente que utiliza el colorante fluorescente Cipro ruby. El método de tinción con Cipro ruby fue diseñado especialmente para su uso en electroforesis bidimensional, pero ha demostrado ser el tinción de geles de proteínas más sensible para la electroforesis estándar unidimensional en SDS-PAGE. Para comenzar, transfiera el gel a un recipiente limpio de polipropileno o PVC de tamaño adecuado.

Incube el gel en la cantidad adecuada de tinción para geles de proteínas cipro ruby sin diluir, con agitación suave continua en un agitador orbital a 50 RPM. Cubra el gel e incube durante al menos tres horas. Transfiera el gel a un recipiente de tinción limpio y lávelo una vez con una solución de 10% metanol, 7% ácido acético, recupere y coloque nuevamente el gel sobre el agitador durante 30 minutos.

Con el fin de reducir la fluorescencia de fondo y aumentar la sensibilidad, ahora el gel está listo para ser observado y fotografiado. Quiero agradecerles por ver los protocolos de hoy. Les hemos mostrado varios procedimientos diferentes para visualizar proteínas tras la electroforesis.

Algunos son muy sensibles, como la tinción fluorescente y la tinción con plata, y otros son rutinarios, como la tinción con azul de kamasi. Es importante recordar que la pureza de los reactivos es fundamental. El uso de agua ultrapura también es muy importante, al igual que el tiempo empleado en cada uno de los pasos.

Debe prestar mucha atención a eso para obtener también resultados reproducibles. Eso es todo y mucha suerte en su próximo conjunto de experimentos.