Tinción de proteínas en geles de

En un video anterior titulado Separación electroforética de proteínas, demostramos cómo se podía separar una mezcla compleja de proteínas mediante electroforesis en gel. En este vídeo, te mostraremos cuatro métodos diferentes de tinción en gel para visualizar la ubicación de las proteínas en el gel. Hola, soy Sean Gallagher de UVP y trabajo con el Centro de Proteómica aquí en el Instituto de Posgrado KEG.

Hoy les mostraré una serie de técnicas para visualizar proteínas después de la separación por electroforesis. Esto incluye la tinción de plata azul Kamasi, naranja cyro y rubí cyro. Así que comencemos con Kamasi blue primero.

La detección de prohibiciones de proteínas en un gel mediante la tinción con azul de Kamasi depende de la unión inespecífica de un colorante. En este caso, Kamasi azul brillante G two 50. En este método, las proteínas separadas en un gel de poliacrilamida se lavan con agua de alta pureza.

A continuación, se detecta la ubicación de las proteínas mediante una tinción de azul de kamasi a base de agua. El límite de detección es de 0,3 a un microgramo por banda de proteína. Para empezar, comience con un gel de poliacrilamida en el que las proteínas se han separado mediante electroforesis.

Mientras agita, coloque lentamente el gel de poliacrilamida en un recipiente de plástico lleno de 300 mililitros de agua de alta pureza. Dejar actuar durante cinco minutos. Deseche y repita dos veces más después del tercer lavado.

Vierta el agua y cubra el gel con la solución de tinción azul de Kamasi durante una hora mientras agita lentamente después de una hora de tinción, vierta la solución de tinción. Enjuague el gel brevemente colocándolo en unos 200 mililitros de agua durante 30 minutos. En este punto, el gel puede almacenarse en agua para futuras imágenes.

El gel también se puede secar en esta etapa para mantener un registro permanente del gel. Para hacer esto, coloque el gel en dos hojas de papel de filtro Watman de tres mm y cubra la parte superior con una envoltura de plástico. A continuación, séquelo en un secador de gel convencional durante una o dos horas a unos 80 grados centígrados.

Otro método de tinción de proteínas es la tinción con plata, que demostraremos a continuación. Aunque el método de tinción con azul de Kamasi es más fácil y rápido, la tinción con plata es considerablemente más sensible con un límite de detección de 0,3 nanogramos BSA. La detección de bandas de proteínas en un gel mediante tinción de plata depende de la unión de la plata a varios grupos químicos de la proteína.

El siguiente protocolo se basa en el kit de tinción de plata Silver Quest de in Vitrogen. El protocolo se deriva del protocolo de tinción rápida, de aproximadamente 30 minutos, y representa una de las muchas químicas basadas en kits que se utilizan para la tinción de plata compatible con la espectrometría de masas. En este caso, utilizaremos un mini gel prefabricado in vitrogen antes de comenzar la tinción de plata.

Asegúrese de usar guantes en todo momento para evitar la contaminación de las huellas dactilares. Coloque el gel en una bandeja apta para microondas con 100 mililitros de agua apta para reactivos. Enjuague brevemente y luego vierta el agua.

A continuación, agregue 100 mililitros de fijador, compuesto por 40% de etanol, 10% de ácido acético en agua de alta pureza y cocine en el microondas durante 30 segundos. El proceso de microondas acorta los pasos de incubación necesarios al acelerar la unión y la tinción. En este punto, coloque el gel en una coctelera y muévase lentamente durante cinco minutos.

Después de cinco minutos, vierta el fijador, agregue 100 mililitros, etanol al 30% para lavar el gel en el microondas durante 30 segundos y luego coloque el gel en una coctelera durante cinco minutos. Después de cinco minutos, vierta el etanol. Ahora agregue 100 mililitros de reactivo sensibilizante en el microondas durante 30 segundos y luego colóquelo en una coctelera durante dos minutos.

Pasados los dos minutos, vierta el reactivo sensibilizante. Agregue 100 mililitros de agua de grado reactivo en el microondas durante 30 segundos y colóquelo en una coctelera durante dos minutos. Vierta y repita durante un total de dos ciclos de lavado.

Ahora agregue 100 mililitros de solución para manchar, cocine en el microondas durante 30 segundos y agite lentamente durante cinco minutos. Pasados los cinco minutos, vierte la solución de tinción. Agregue 100 mililitros de agua de grado reactivo, omita el microondas, paso y colóquelo directamente en una coctelera durante 20 a 60 segundos.

Deseche el agua e inmediatamente agregue 100 mililitros de la solución de desarrollo y desarrolle hasta que las bandas de proteínas se hagan visibles. Con el fondo despejado, esto tomará aproximadamente de cinco a 10 minutos. En este punto, agregue 10 mililitros de solución de tapón al revelador para detener el desarrollo y obtener mejores resultados.

Fotografíe el gel lo antes posible, ya que puede haber ligeros cambios en la intensidad del color y aumentos en elementos de fondo no específicos. Con el tiempo, el gel que está viendo contiene proteínas residuales Después del electrotransferencia, seque el gel para mantener un registro permanente o guárdelo en una bolsa de plástico hermética. A continuación, demostramos un método para teñir geles con fluorescencia.

Los tintes fluorescentes tienen una serie de ventajas sobre las tinciones de proteínas tradicionales. Las tinciones de gel de proteína de naranja Cipro, que describiremos aquí, pueden detectar de uno a dos nanogramos de proteína por banda. Esto es más sensible que la tinción azul brillante kamasi y tan sensible como muchas técnicas de tinción de plata.

La tinción fluorescente es sencilla, con menos tiempo de manipulación que los protocolos típicos de tinción de plata y se completa en menos de una hora. Las proteínas teñidas se pueden visualizar utilizando un transluminador UV estándar de 300 nanómetros o un escáner láser. En este caso, volveremos a utilizar un mini gel prefabricado in vitrogen para comenzar a preparar y separar las proteínas utilizando la página SDS.

Pero use 0.05%SDS en el búfer en ejecución en lugar del 0.1%SDS habitual para reducir la fluorescencia de fondo. Para comenzar el procedimiento de tinción, vierta la solución de tinción fluorescente de naranja cipro en un plato de plástico pequeño para uno o dos mini geles de tamaño estándar. Use unos 50 mililitros de solución para teñir.

Es importante tener en cuenta que los platos que manchan deben limpiarse y enjuagarse bien antes de usarlos, ya que cualquier detergente interferirá con las manchas. Ahora, coloca el gel en la solución para manchar. Cubre el recipiente con papel de aluminio para proteger el tinte de la luz brillante.

Agite suavemente el gel a temperatura ambiente durante 40 a 60 minutos. Deseche la solución de tinción y luego enjuague el gel durante menos de un minuto con ácido acético al 7,5%, aproximadamente 100 mililitros para eliminar el exceso de mancha de la superficie del gel, detenga el gel incubando durante la noche en 0,1% entre 20 para visualizar y fotografiar bandas de proteínas. Coloque el gel marcado con fluorescencia directamente sobre un transluminador estándar de 300 nanómetros o un transluminador de luz azul.

A continuación, demostraremos un método alternativo de tinción fluorescente, que utiliza el colorante fluorescente Cipro ruby. El método de tinción de rubí Cipro fue diseñado especialmente para su uso en páginas bidimensionales, pero ha demostrado ser la tinción de gel de proteínas más sensible para la página SDS unidimensional estándar. Para comenzar, transfiera el gel a un plato limpio de polipropileno o PVC del tamaño adecuado.

Incubar el gel en la cantidad adecuada de tinción de gel de proteína cipro ruby sin diluir con una agitación suave y continua en un agitador orbital a 50 RPM. Cubra el gel e incube durante al menos tres horas. Transfiera el gel a un plato limpio para manchar y lávelo una vez en una solución de 10% de metanol y 7% de ácido acético, recupere y vuelva a colocar el gel en el balancín durante 30 minutos.

Con el fin de reducir la fluorescencia de fondo y aumentar la sensibilidad, el gel ya está listo para ser visto y fotografiado. Quiero agradecerles por ver los protocolos de hoy. Le hemos mostrado una serie de procedimientos diferentes para visualizar proteínas después de la electroforesis.

Algunos son muy sensibles, como la tinción fluorescente y la tinción con plata, y otros son rutinarios, como la tinción con azul kamasi. Es importante recordar que la pureza del reactivo es fundamental. El uso de agua ultra pura también es muy importante, y también el tiempo en cada uno de los pasos.

Debe prestar mucha atención a eso para obtener resultados reproducibles también. Eso es todo y buena suerte en tu próximo conjunto de experimentos.