Rápido y sensible coloidal Coomassie G-250 La tinción de proteínas en geles de poliacrilamida

En este video, demostraremos el poder de un protocolo de tinción de kumasi modificado para detectar varios nanogramos de proteína en geles de poliacrilamida. Usando el ejemplo de la electroforesis en gel bidimensional antes de la separación de la primera dimensión. Las tiras de gradiente de pH inmovilizadas se rehidratan en condiciones de tampón desnaturalizante.

Después de la rehinchazón de las tiras durante la noche, las muestras de proteínas se aplican mediante carga de copa anódica. Durante el proceso de enfoque, las proteínas se separan de acuerdo con sus puntos isoeléctricos. La separación de la segunda dimensión se realiza mediante la página SDS.

A continuación, el gel se transfiere a una placa de tinción y las proteínas se detectan mediante tinción con kumasi coloidal. Hola, soy Nadine de Bala del laboratorio de Sabina Meka en el centro de investigación médico biológico de la Universidad de Olor. Hoy llamaré su atención sobre un procedimiento ampliamente no famoso según los colegas de Kangan, Cy Brilliant Blue es un dique comúnmente utilizado para la visualización de proteínas después de separaciones electroforéticas, pero a menudo se asume que es menos aplicable para la proteómica comparativa.

Sin embargo, la tinción coloidal cos ofrece características superiores en cuanto a sensibilidad, costos y practicidad. Utilizamos el protocolo de tinción K en nuestro laboratorio para una aplicación casi promedio basada en gel, pero especialmente en proteómica analítica para determinar los cambios en la expresión de proteínas miocárdicas. Demostraré el uso de este método para detectar proteínas miocárdicas en el rango de pH alcalino de geles de electroforesis bidimensionales.

Así que comencemos. Entiendo. La primera dimensión de la electroforesis en gel 2D es el enfoque isoeléctrico o IEF y para este análisis se utilizan tiras de gradiente de pH inmovilizadas o tiras IPG.

Antes de la IEF, cuatro tiras de IPG se rehidratan individualmente en 125 microlitros de solución de rehidratación utilizando la bandeja de hinchamiento de tiras secas IM Mobilly durante al menos 10 horas cuando las tiras de IPG están rehidratadas y listas para la aplicación de muestras de proteínas. Las muestras de proteína precipitada con TCA de cuatro preparaciones cardíacas diferentes se disuelven en el tampón de muestra IEF a una concentración de 100 microgramos de proteína por 100 microlitros. La solubilización de las muestras de proteínas tomará al menos 30 minutos a temperatura ambiente en un vórtice.

Mientras tanto, prepare los componentes adicionales del kit de tiras secas IM Molene para realizar IEF en la unidad de electroforesis multi four. En primer lugar, ajuste la temperatura de la unidad de refrigeración a 20 grados centígrados, pipetee de tres a cuatro mililitros de líquido de cobertura en la placa de refrigeración y coloque la bandeja de tiras secas Immobilien sobre ella con la conexión del electrodo rojo hacia el ánodo. Vierta unos 10 mililitros de aceite de cubreobjetos en la bandeja de tiras secas Immobilien y coloque el alineador de tiras secas Immobilien con el lado de la ranura hacia arriba sobre la bandeja recubierta de aceite.

A continuación, retire la tira rehidratada de la bandeja de rehinchamiento y transfiérala con el lado del gel hacia arriba a las ranuras del alineador. El extremo ácido de la tira debe mirar hacia el ánodo. Al final, todas las tiras deben estar alineadas con sus bordes anódicos.

Coloque tiras de electrodos saturadas con agua destilada lateralmente a través de los extremos de las tiras de gel, asegurándose de que las tiras de electrodos entren en contacto al menos parcialmente con la superficie del gel. Finalmente, coloque los electrodos en las tiras de electrodos de modo que la marca de color se dirija hacia el contacto electrónico correspondiente. Coloque la barra de copa de muestra cerca del ánodo en la bandeja de tiras secas de immobilien y coloque una taza de muestra encima de cada tira de IPG.

Presione suavemente las copas de muestra hacia abajo para asegurar un buen contacto con la tira de IPG. Vierta de 70 a 80 mililitros de aceite de cobertura en la bandeja para cubrir las tiras de IPG. No debe gotear aceite en los vasos de muestra.

Si se filtra aceite en la taza, retírela con una pipeta y vuelva a ajustar las tazas. Finalmente, agregue unos 150 mililitros de aceite de cobertura para cubrir completamente los vasos de muestra. A continuación, aplique las muestras de proteínas en los recipientes de muestra pipeteando por debajo de la superficie del líquido de cobertura.

El volumen de la taza es de 100 microlitros. Una vez que se hayan aplicado todas las muestras de proteínas, conecte todos los cables. Conecte la unidad multi cuatro a la fuente de alimentación y realice el enfoque isoeléctrico durante 11,1 kilovoltios por hora en modo de gradiente siguiendo IEF, las tiras de IPG se colocan en una bandeja con el lado del gel hacia arriba y se someten a reducción y alquilación durante el equilibrio.

Para la reducción, use 2,5 mililitros de solución de equilibrio al 1%DI tres y todos por tira. Después de eso, agite durante 15 minutos y luego reemplace completamente la solución de DTT y alquile las tiras en una solución de equilibrio de acetamida al 2,5% de I oto agitar durante otros 15 minutos. Enjuague las tiras de equilibrio una vez en un vaso de precipitados lleno de agua y séquelas sobre papel de filtro para eliminar el exceso de tampón de equilibrio.

A continuación, transfiera las tiras en un búfer de ejecución XSDS. Las proteínas de las tiras ya están listas para la segunda dimensión de la electroforesis en gel 2D. La segunda dimensión se realiza mediante la página SDS en un sistema de electroforesis vertical.

Un número adecuado de un milímetro de grosor. Los geles de acrilamida al 12% se moldean un día antes de su uso y se mantienen cubiertos con papel húmedo. A temperatura ambiente, las tiras de IPG equilibradas se colocan en la parte superior de los geles separadores y se fijan con una solución agrícola caliente por proteínas que se separan durante 2,5 horas, comenzando a 80 voltios durante 15 minutos, seguido de 120 voltios hasta que el frente de tinte llega al fondo del casete de gel.

Mientras las proteínas se separan por la página SDS, prepare las soluciones para la tinción de kumasi coloidal en el gel. Al hacer la solución de tinción, es muy importante mantener la adición secuencial de los componentes en el siguiente orden. Primero, disuelva 100 gramos de sulfato de aluminio y aproximadamente 1,5 litros de agua en cubos de precipitados y revuelva Después de que se disuelva el sulfato de aluminio, mezcle 200 mililitros de etanol y agregue 0,4 gramos de CBG dos 50 a la solución.

Tan pronto como el CBB G two 50 se haya disuelto por completo, agregue 47 mililitros de ácido ortofosfórico. Este paso permite que las moléculas de kamasi se agreguen a su estado coloidal. Por último, añade mili Q de agua hasta un volumen final de dos litros.

La solución final en pie tendrá partículas nadando alrededor. No filtre esta solución. La solución para tinciones también puede prepararse con anticipación y almacenarse en la oscuridad hasta su uso.

Cuando se complete el gel SDS. Retire con cuidado el gel de las placas de vidrio y transfiéralo a un plato de tinción lleno de agua Milli Q. Coloque el plato con el gel en una coctelera horizontal y agite durante 10 minutos.

Repita el lavado dos veces más durante unos cinco a 10 minutos. Con agua fresca de milicubos, es importante lavar bien el gel porque los SDS restantes en el gel pueden interrumpir la unión del tinte a la proteína y causar poca sensibilidad. Al final del tercer lavado, vierta el agua del plato.

El gel ya está listo para ser teñido. Primero, agite la solución de Kumasi para dispersar las partículas coloidales de manera uniforme. A continuación, añade suficiente solución para cubrir el gel.

Coloque el plato con la solución de Kumasi tapada. Gel en una coctelera y agite durante dos a 12 horas. Después de 10 minutos, verás aparecer las primeras manchas de proteína.

Del 80 al cien por ciento de la tinción se puede lograr dentro de las dos horas posteriores a la incubación. Pero recomendamos una incubación durante la noche para lograr una tinción cercana al 100%. Una vez finalizada la tinción, retira la solución de Kamasi y enjuaga el gel dos veces con agua Milli Q.

Después de enjuagar el gel, retira las partículas de tinte adheridas del plato para manchar con una toalla de papel sin pelusa. Agregue la solución desmanchante al gel y manténgalo durante 10 a 60 minutos en la agitadora. Por último, enjuaga el gel dos veces con agua Milli Q.

El gel recuperará su espesor original y la intensidad del color de la mancha de kumasi también se verá realzada. Si sigues este protocolo, tu gel 2D debería estar claramente resuelto y teñido bien con manchas de proteínas de color azul oscuro. El resultado de nuestra tinción kumasi de geles 2D es comparable al de la tinción con plata.

De acuerdo con el protocolo de Chef Chenko et al, el cual se reporta como de alta sensibilidad y compatibilidad con espectrometría de masas. Utilizando el ejemplo de la electroforesis en gel bidimensional, acabamos de mostrarte lo rápido, sencillo y sensible que es el sostenimiento del kangs cooma. Para detectar proteínas en geles de acrilamida po, el sostenimiento puede completarse en dos horas.

El procedimiento en sí requiere poca mano de obra. Y por último, pero no menos importante, es posible que pueda detectar tan solo un nanogramo de proteína. Por lo tanto, este protocolo es definitivamente una buena alternativa a los métodos de desetiquetado de la proteómica basada en jaulas.

Cuando utilice el procedimiento de sostenimiento, es importante recordar que debe utilizar productos químicos analíticos y agua de la más alta pureza. Además, la adición secuencial de los componentes a la solución de tinción es un paso crítico en la preparación. Por último, no olvide lavar eficazmente los SDES residuales de los geles después de la separación electroforética.

De lo contrario, no verás nada en tus geles. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.