Rápido y sensible coloidal Coomassie G-250 La tinción de proteínas en geles de poliacrilamida

En este video, demostraremos la potencia de un protocolo modificado de tinción de kumasi para detectar varias nanogramos de proteína en geles de poliacrilamida. Utilizando como ejemplo la electroforesis en gel bidimensional antes de la separación en la primera dimensión. Las tiras de gradiente de pH inmovilizado se rehidratan en condiciones de tampón desnaturalizante.

Después de la rehidratación nocturna de las tiras, las muestras de proteínas se aplican mediante carga en cubeta anódica. Durante el proceso de enfoque, las proteínas se separan según sus puntos isoeléctricos. La separación en segunda dimensión se realiza mediante electroforesis SDS-PAGE.

El gel se transfiere entonces a un recipiente de tinción y las proteínas se detectan tiñendo con kumasi coloidal. Hola, soy Nadine de Bala del laboratorio de Sabina Meka en el centro de investigación biomédica de la Universidad de Olor. Hoy llamaré su atención sobre un procedimiento poco conocido según Kangan y colegas: el Azul Brillante C, un colorante comúnmente utilizado para la visualización de proteínas tras separaciones electroforéticas, pero que a menudo se considera menos aplicable para la proteómica comparativa.

Sin embargo, la tinción coloidal de Coomassie ofrece ventajas superiores en cuanto a sensibilidad, costos y practicidad. Utilizamos el protocolo de tinción K en nuestro laboratorio para aplicaciones basadas en geles promedio, pero especialmente en proteómica analítica para determinar cambios en la expresión de proteínas miocárdicas. Demostraré el uso de este método para detectar proteínas miocárdicas en el rango de pH alcalino de geles de electroforesis bidimensional.

Así que comencemos. Entendido. La primera dimensión de la electroforesis en gel bidimensional es el enfoque isoeléctrico o IEF, y se utilizan tiras con gradiente de pH inmovilizado o tiras IPG para este análisis.

Antes de la IEF, se rehidratan individualmente cuatro tiras IPG en 125 microlitros de solución de rehidratación utilizando la bandeja de hinchamiento para tiras secas IM Mobilly durante al menos 10 horas, momento en el cual las tiras IPG estarán rehidratadas y listas para la aplicación de las muestras proteicas. Las muestras proteicas precipitadas con TCA provenientes de cuatro preparaciones cardíacas diferentes se disuelven en tampón de muestra para IEF hasta una concentración de 100 microgramos de proteína por 100 microlitros. La solubilización de las muestras proteicas requerirá al menos 30 minutos a temperatura ambiente en un vórtex.

Mientras tanto, prepare los componentes adicionales del kit seco IM Molene para realizar la IEF en la unidad de electroforesis multi cuatro. Primero, ajuste la temperatura de la unidad de enfriamiento a 20 grados Celsius, pipetee de tres a cuatro mililitros de líquido de cobertura sobre la placa de enfriamiento y coloque la bandeja para tiras secas Immobilien sobre ella, con la conexión roja del electrodo hacia el ánodo. Vierta aproximadamente 10 mililitros de aceite de cobertura en la bandeja para tiras secas Immobilien y coloque el alineador para tiras secas Immobilien con el lado de la ranura hacia arriba sobre la bandeja cubierta de aceite.

A continuación, retire la tira rehidratada de la bandeja de hinchamiento y transfiérala con el lado del gel hacia arriba a las ranuras del alineador. El extremo ácido de la tira debe orientarse hacia el ánodo. Al final, todas las tiras deben alinearse con sus bordes anódicos.

Coloque tiras de electrodo saturadas con agua destilada lateralmente en los extremos de las tiras de gel, asegurándose de que las tiras de electrodo hagan contacto al menos parcial con la superficie del gel. Finalmente, coloque los electrodos sobre las tiras de electrodo de modo que la marca de color esté orientada hacia el contacto electrónico correspondiente. Coloque la barra de pocillos de muestra cerca del ánodo en la bandeja seca de tiras inmovilizadas y coloque un pocillo de muestra encima de cada tira IPG.

Presione suavemente los vasos de muestra para asegurar un buen contacto con la tira IPG. Vierta entre 70 y 80 mililitros de aceite de cobertura en la bandeja para cubrir las tiras IPG. No debe haber fugas de aceite hacia los vasos de muestra.

Si el aceite se filtra al vaso, retírelo con una pipeta y ajuste nuevamente los vasos. Finalmente, agregue aproximadamente 150 mililitros de aceite de cobertura para cubrir completamente los vasos de muestra. Ahora aplique las muestras de proteína en los vasos de muestra pipeteando debajo de la superficie del líquido de cobertura.

El volumen del vaso es de 100 microlitros. Una vez que se hayan aplicado todas las muestras de proteína, conecte todos los cables. Conecte la unidad múltiple de cuatro a la fuente de alimentación y realice la electroenfoque isoeléctrico durante 11,1 kilovoltios por hora en modo gradiente. Tras el IEF, las tiras IPG se colocan en una bandeja con el lado del gel hacia arriba y se someten a reducción y alquilación durante la etapa de equilibración.

Para la reducción, utilice 2,5 mililitros de solución de equilibrio 1% DI tres et all por tira. Después, agite durante 15 minutos y luego reemplace completamente la solución de DTT y alquile las tiras en solución de equilibrio con iodoacetamida al 2,5% con agitación durante otros 15 minutos. Enjuague las tiras equilibradas una vez en un vaso de precipitados lleno de agua y séquelas sobre papel de filtro para eliminar el exceso de tampón de equilibrio.

A continuación, transfiera las tiras a un tampón de electroforesis XSDS. Las proteínas en las tiras ya están listas para la segunda dimensión de la electroforesis en gel 2D. La segunda dimensión se realiza mediante SDS-PAGE en un sistema de electroforesis vertical.

Se preparan un número adecuado de geles de acrilamida al 12 % de un milímetro de espesor un día antes de su uso y se mantienen cubiertos con papel húmedo. A temperatura ambiente, las tiras IPG equilibradas se colocan sobre la parte superior de los geles de separación y se fijan con solución de agarosa caliente; las proteínas se separan durante 2,5 horas, comenzando a 80 voltios durante 15 minutos, seguido de 120 voltios hasta que el frente del colorante alcance la parte inferior del casete del gel.

Mientras las proteínas se separan mediante electroforesis SDS-PAGE, prepare las soluciones para la tinción coloidal con kumasi en el gel. Al preparar la solución de tinción, es muy importante mantener el orden secuencial de adición de los componentes en el siguiente orden. Primero, disuelva 100 gramos de sulfato de aluminio y aproximadamente 1,5 litros de agua milicúbica en un vaso de precipitados y agite. Una vez disuelto el sulfato de aluminio, mezcle 200 mililitros de etanol y añada 0,4 gramos de CBG dos 50 a la solución.

Una vez que el CBB G dos 50 se haya disuelto completamente, agregue 47 mililitros de ácido ortofosfórico. Este paso permite que las moléculas de kamasi se agreguen en su estado coloidal. Finalmente, agregue agua milli Q hasta un volumen final de dos litros.

La solución final en reposo tendrá partículas nadando en ella. No filtre esta solución. La solución de tinción también puede prepararse con antelación y almacenarse en la oscuridad hasta su uso.

Una vez finalizado el gel de SDS, retire cuidadosamente el gel de las placas de vidrio y transfiéralo a un recipiente para tinción lleno con agua Milli Q. Coloque el recipiente con el gel sobre un agitador horizontal y agite durante 10 minutos.

Repita el lavado otras dos veces durante aproximadamente cinco a 10 minutos. Con agua fresca de milicubo, es importante lavar bien el gel porque el SDS residual en el gel puede interrumpir la unión del colorante a la proteína y provocar una baja sensibilidad. Al final del tercer lavado, deseche el agua del recipiente.

El gel ya está listo para ser teñido. Primero, agite la solución Kumasi para dispersar uniformemente las partículas coloidales. Luego, añada suficiente solución para cubrir el gel.

Coloque el recipiente con la solución de Kumasi tapado. Incube en agitador durante dos a doce horas. Después de 10 minutos, observará la aparición de los primeros puntos proteicos.

Entre el 80 y el 100 % de la coloración puede lograrse dentro de dos horas de incubación. Sin embargo, recomendamos una incubación nocturna para alcanzar una coloración cercana al 100 %. Cuando la coloración esté completa, retire la solución de Kamasi y lave el gel dos veces con agua Milli Q.

Después de enjuagar el gel, retire las partículas de colorante adheridas del recipiente de tinción con una toalla de papel sin pelusa. Añada la solución de descoloración al gel y deje reposar entre 10 y 60 minutos en el agitador. Finalmente, enjuague el gel dos veces con agua Milli Q.

El gel recuperará su grosor original y la intensidad del color de la tinción kumasi también se verá potenciada. Si sigue este protocolo, su gel bidimensional debería presentar una resolución clara y una tinción adecuada con manchas proteicas de color azul oscuro. El resultado de nuestra tinción kumasi en geles bidimensionales es comparable al de la tinción argéntica.

Según el protocolo de Chef Chenko et al., que se informa que tiene alta sensibilidad y compatibilidad con espectrometría de masas. Usando como ejemplo la electroforesis en gel bidimensional, acabamos de mostrarle lo rápida, sencilla y sensible que es la sostenibilidad de kangs cooma. Para detectar proteínas en geles de acrilamida po, la sostenibilidad puede completarse en menos de dos horas.

El procedimiento en sí requiere poca mano de obra. Y para finalizar, es posible que logre detectar tan solo un nanogramo de proteína. Por lo tanto, este protocolo es sin duda una buena alternativa a los métodos sin marcaje de la proteómica basada en geles.

Cuando se utiliza el procedimiento de mantenimiento, es importante recordar usar productos químicos de grado analítico y agua de la máxima pureza. Además, la adición secuencial de los componentes a la solución de tinción es un paso crítico en la preparación. Por último, no olvide lavar eficazmente los residuos de SDES de los geles después de la separación electroforética.

De lo contrario, no verá nada en sus geles. Eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.