Summary
Intravital photoswitching och spårning av Dendra2 märkt tumörceller via mammary Imaging Fönster är en teknik som tillåter oss att bilden av metastaserande beteendet hos tumörceller i utvalda tumör mikromiljöer över en tidsskala av dagar.
Abstract
Under det senaste decenniet, intravital mikroskopi av bröst-tumörer hos möss och råttor vid encelliga upplösning
Protocol
1. Generering av fluorescerande tumörer med hjälp av injektion av tumörceller i juverfett pad:
- Odla en cellinje som uttrycker Dendra2 protein (som cytoplasma markör) till 40 - 80% confluency.
- Skölj rätter minst 3 gånger med PBS w / o Ca 2 + eller Mg 2 +.
- Tillsätt 3 ml trypsin per 10 cm parabolantenn och inkubera vid 37 ° C tills de flesta celler lossnar och då slå skålen mot en plan yta att skaka den.
- Skölj alla celler bort skålen, och använda en skrapa (gummi polis) för att samla in matrisen också. Tillsätt 5 ml PBS. Tag en alikvot att räkna under centrifugering.
- Centrifugera vid 800 gi 5 min.
- Aspirera och återsuspendera i PBS till en koncentration av 5 - 10x 10 6 / ml. Förvara på is tills injiceras (skjuta inom 30 min).
- Placera en bur som innehåller 4-5 veckor gammal tik immun bristfällig möss (t ex SCID) inuti en steril huva.
- Spraya området runt den 4: e (buken) nippel med 70% etanol.
- Injicera 0,1 ml i juverfett pad. Om en assistent kan hittas, kan en person hålla musen på plats medan den andra sätter nålen inuti juverfett pad. Om du injicerar själv, placera mus under lätt narkos med isofluran.
- När tumören har vuxit till 5-7 mm, bör de mammary Imaging fönster (MIW) införas.
Obs: Alternativt för vissa tillämpningar kan MIW läggas på toppen av den friska juverfett pad och cellerna kan injiceras efteråt. Detta synsätt tillåter avbildning av övergående transfekterade celler i en fysiologisk miljö.
2. Manuell tillverkning av de mammary Imaging Window (MIW):
- MIWs (Figur 1A) är gjorda av vävnad klass plast för att garantera biokompatibilitet. För manuell konstruktion, använder vi 5 eller 10 cm rätter.
- Sätt latexhandskar på.
- Hetta upp en vävnad-kultur skålen och creat en krökt yta genom att trycka en rundad, hårt föremål mot den uppvärmda skålen (vi använder en 1-tums dremmel lite för detta).
- Klipp ut i mitten av skålen med hjälp av en uppvärmd rakblad.
- Använd en liten konformad dremmel lite för att göra ett hål i mitten av kupolformade plastbas (6-7mm i diameter).
- Gör kanterna på plastbas helt slät genom att slipa den med dremmel och ytterligare arkivering det.
- Arkiv toppen av plast basen gör en plan yta för glaset täckglas. Diametern på arkiveras och plan yta ska vara 9-10mm.
- Limma 8mm runda glas täckglas (nummer 1) på platta yta med hjälp av superlim (cyanoakrylatlim).
- Vänta tills limmet torka (15 minuter).
- Använd en uppvärmd 26G nål för att göra åtta suturering hål punktering från utsidan (där glaset är) på insidan av basen. Hålen ska vara jämnt fördelade runt täckglas, 0,5-1mm från kanten av täckglas.
- Vidga hålen med en 5-0 suturering nål.
- Punktera hål i plasten basen kommer att göra den inre ytan ojämn. Använda sandpapper, gör detta ytan helt slät.
- Byt handskar och borsta av små plastpartiklar från MIW med en liten borste.
- Tvätta MIW med avjoniserat vatten.
- Tvätta MIW med 70% etanol. Använd en tops för att rengöra glaset så det är helt genomskinligt. Om det finns dimmiga fläckar närvarande från limmet ånga, försiktigt använd aceton med en tops.
- Sterilisera MIW av UV-exponering under 3 timmar vid varje sida.
Semi-Manuell tillverkning av de mammary Imaging Window (MIW):
För att tillverka plast bas, vi använder silikon formar gummi gjutning skapas med hjälp av handgjorda MIWs. Formen består av två delar av silikongummi som gör en exakt kopia av både fram-och baksidan av originalet när den är fylld med polyester harts och sedan omedelbart ihop. Den flytande polyester blandas ihop 9:10 och resulterar i en hård struktur när fullt frisk i 48h. Plasten är UV-skyddad och arkivens utan att bryta ner eller bli gult med tiden.
Efter att grundsystemet är botad, steg från 2,8 till 2,16 är gjort på samma sätt som för manuellt tillverkade MIWs.
3. Införande av MIW:
- Området runt den 4: e bröstvårtan bör ha en liten (5-7 mm i diameter) tumör flera dagar / veckor efter injektion av tumörceller beroende på vilken celltyp (Figur 1B). Hur mycket tid har gått efter injektionen av celler som uttrycker Dendra2 photoswitchable protein eller andra fluorescerande proteiner beror på vilken cellinje. Tumören ska inte vara synligt nekrotisk, och bör ha en intakt hud med hår på toppen av tumören. Möss med nekrotiska tumörer bör avlivas.
- Förbered sterila utrymme för kirurgi-fastställa en bit av steril duk i en steril huva. Lägg en bit av steril gauze i mitten, och lägg några MIWs och sterila instrument runt det: vi använder mindre vanliga saxar, våren sax, microdissecting pincett, microdissecting pincett, nål. Håll sterila Q-tips, en flaska 70% etanol och sterila handskar i hörnet av huven.
- Musen är sövda i det sterila köksfläkten med IP-injektion av 2,5% AVERTIN (20 l / g) i HBSS, alternativt 10 mikrogram / kg ketamin + 10 mikrogram / g xylazin (kontakta Institute Djurvård för godkännanden och beställning).
Obs: Avertin lösning bör vara beredd varannan vecka, filtrera steriliseras med en 0,22 ìm filter och lagras som 500 l alikvoter vid 4 ° C (i mörker). - Ta bort hår genom att raka området ovanför tumören med hjälp av ett litet djur rakapparat.
- Ta bort resten av håret med hjälp av Nair hårborttagningskräm (finns i alla apotek). Rengör huden med etanol-doppad Q-tips.
- Överför djuret på steril gasbinda och tillämpa oftalmologiska salva till ögonen för att hålla dem från uttorkning och infektion.
- Sterilisera huden med Betadine och ren med 70% etanol.
- Överför djuret på ett sterilt kirurgiskt trasa innanför sterila huvan.
- Dra genast huden mediala till bröstvårtan med pincett och skär ~ 2 mm snitt i huden.
- Separera underliggande juverfett pad från huden med hjälp av dissektion sax och pincett. Huden och hål sträcka under denna separation steg till en storlek som kommer att rymma isättningen av MIW.
- Om misstag ett fartyg drabbas under sugery, använda en steril Q-tips att ta bort blod som produceras / för att stoppa blödningen blir alltför omfattande.
- Sätt MIW sådan att det finns hud ovanpå MIW bas och sutur på plats med icke absorberbara tråd och omvänd skärande nål.
- Använd vävnad lim eller cyanoakrylat att fylla i suturering hålen och säkra MIW på huden.
- Lägg TMP-SMX antibiotika mix: (Sulfametoxazol 0,6 mg / ml, Trimetoprim 0,12 mg / ml) i buren vattenflaska för 3 dagar före och efter operationen.
- Djuret stannar under narkos för 1-4h efter AVERTIN IP-injektion. Sedan operationen vanligen tar ~ 45min, är det viktigt att hjälpa djuret återhämta sig efteråt:
- Placera en pad handen värme (37 ° C) (finns på apotek) på botten av buren och täck den med gasväv.
- Håll djuret ovanpå plattan tills den blir på sin mage och börjar gå.
- Om djuret är medvetslös i mer än 3 timmar, injicera 0,3 ml HBSS intraperitonealt för rehydrering.
- Djuret får återhämta sig under de närmaste 3-4 dagar före den första avbildning mötet äger rum.
4. Imaging Boxkonstruktion
Den avbildning rutan försäkrar att MIW sitter platt, precis ovanför mikroskop målet. Det underlättar också temperatur och anestesi kontroll genom konstant luftflöde av isofluran. Boxen är tillverkad i plexiglas och limmas ihop med plast svetsa. Den är utrustad för det specifika mikroskopet skede och därför formen på botten varierar beroende på i mikroskop som används (Figur 2 visar systemet av lådan monteras på Leica SP5 mikroskop scenen).
Mått på lådan i centimeter är l = 11,4 cm, B = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Figur 2A). I botten av lådan består av en ihålig plåt 12.7x8.4 cm i storlek, som passar in i Leica SP5 mikroskop skede och två glidande "dörrar", 5,7 X 5,7 cm_each, som bildar en rund öppning (d = 2,22 cm ) när det är stängt. Den MIW passar in i denna öppning. Framstycket innehåller inlopp hålet för anestesiapparater medan en av sidostyckena innehåller ett utlopp hål som leder till vakuum.
Observera att kondensorn och skjut hållaren behöver tas bort innan avbildning rutan placering.
5. Imaging Box Använd
- Placera djuret under anestesi med isofluran och tillämpa oftalmologiska salva för ögonen.
- Fäst isofluran avgaser från anestesiapparaten till bildbehandling rutan fram, på utsidan av inloppet hålet (Figur 2B).
- Fäst en andra slang till utloppet hålet på avbildning rutan. Detta rör ska bifogas gasen filtret och sedan till vakuum.
- Öppna lådan locket och öppna lådan dörrarna och placera djuret, MIW vänd botten, och skjuta dörrarna i rutan.
- Håll lådan och justera ner dörrar så att MIW basen hålls och immobiliserade mellan dem. Den MIW grunden bör vara på samma nivå som dörrarna avbildning rutan medan MIW täckglas bör bara några millimeter under denna nivå. Se till att placeringen av MIW mellan botten skjutdörrar gör att täckglas (glas delen av MIW) ligger plant, parallellt med den nedre dörrarna rutan. Detta kommer att säkerställa korrekt fokusering.
- Sänk mikroskop målet, för att ge plats för placering av rutantoppen av mikroskop scenen.
- Placera lådan på mikroskop scenen, och justera skede så att MIW täckglas ligger över målet.
- Fokusera mål och börja avbildning.
- När du använder isofluran, bör djuret övervakas genom visuell kontroll av andningsfrekvens. Detta kan göras visuellt eller genom att övervaka frekvensen av andningen artefakter förekommer under imaging samlingen (dessa kan störa datainsamling). Den MouseOx pulsoximetri systemet (Starr Life Sciences Corp) har använts framgångsrikt. På så sätt uppgifterna kan samlas in kontinuerligt utan att vrida på belysningen i rummet för att kolla på djuret.
Observera: Efter varje avbildning session bör djuret återhämtningen underlättas genom att linda en liten pad handen uppvärmning i gasväv eller kimwipes och sätta den under djuret i buren.
Obs: Om en nedsänkning mål används för att bilden genom MIW bör nedsänkning medium (glycerol, vatten, olja) tvättas bort den avbildning fönstret. Den MIW bör inspekteras för eventuella sprickor eller andra skador som kan ha inträffat under avbildning. Detta är avgörande för att samla in data under flera bildbehandling sessioner.
6. Photoswitching och avbildning av Dendra2-märkta celler
Förfarandet beskrivs för Leica SP5 konfokalmikroskop, lasern makt på fokalplanet, finns mål och alternativ programvara varierar när du använder andra konfokala mikroskop eller multiphoton avbildning ställa upp, och därmed det protokoll som beskrivs nedan bör användas som en guide för att optimera experimentet på mikroskop.
- Genom att observera tumören genom okularet (10x) med grön fluorescens filtret, lokalisera större blodkärl som tydligt flödar och plant i samma fokalplanet.
- Placera ett av fartygen i mitten av fältet och byta till PMT upptäckt.
- Sätt upp sekventiell imaging kollektion för två kanaler. En av de kanaler som använder 488nm laserlinje (10% effekt), och samlar spridningen från extracellulärt matrix (480-495nm) och utsläpp från den gröna formen av Dendra2 (505-540nm). Den andra kanalen använder 543nm laserlinjen (90% effekt) och samlar utsläpp från den röda formen av Dendra2 (555-600Nm). Samla 3D-bilder före photoswitching.
- Använd ROI skanna alternativet att photoswitch en utvald population av celler med 405nm laserlinjen (30% effekt, 20-40 skannar). Samla utsläpp av den röda formen av proteinet att övervaka byta.
- Med samma sekventiella rutin som i 6,3, samla in post-växling 3D-bilder.
- Om photoswitching mer än en region i tumören, är det tillrådligt att ta bilder genom okular med en digitalkamera, i både grön och röd kanaler (Figur 3A, B). Detta kommer att bidra till läggning under de efterföljande avbildning sessioner.
Obs: Dessutom kan blodkärl tillfälligt märkt med svanen-ven injektion av fluorescerande dextran (Cascade Blue eller Alexa Fluor 647, båda 10kDa). Några timmar efter injektionen kommer dextraner lämna blodkärlen och permanent märka makrofager.
Representativa resultat:
Figur 3C visar ett rektangulärt photoswitched region (röd) orienterade vinkelrätt i förhållande till blodkärl (ingen fluorescens). Icke-photoswitched celler är gröna, medan spridningen från den extracellulära matrisen är lila. Bilden är en maximal intensitet projektion av fyra bilder längs z-axeln (20-50 ìm djup).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av US Department of Defense (BC075554 till BG och BC061403 till DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 till JvR, CA100324 till JC, JES och JW, CA77522 till JES, U54CA126511 till JC och BG). Vi tackar D. Entenberg för hjälp med mikroskopi, M. Rottenkolber om hjälp i tillverkningen av avbildning rutan och J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) för F4/80 antikroppen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
