Summary
Meme Görüntüleme Penceresi ile Dendra2 etiketli tümör hücrelerinin intravital photoswitching ve izleme, bize görüntü gün bir zaman ölçeği üzerinde seçilen tümör mikroçevrelerde tümör hücrelerinin metastatik davranış sağlayan bir tekniktir.
Abstract
Tek hücreli çözünürlükte fare ve sıçanlarda son on yıl içinde, meme tümörlerinin intravital mikroskopi
Protocol
1. Floresan tümörlerin meme yağ yastığı içine tümör hücrelerinin enjeksiyonu kullanarak Üretimi:
- % 80 confluency - 40 Dendra2 protein (sitoplazmik bir belirteci olarak) ifade eden bir hücre hattı büyütün.
- PBS w / o Ca 2 yemekleri en az 3 kez durulayın + veya Mg 2 +.
- 37 10 cm çanak ve inkübe başına 3 ml tripsin ekle ° C hücrelerinin çoğu ayırmak ve daha sonra düz bir yüzeye karşı çanak vurmak sallamak kadar.
- Çanak kapalı tüm hücreleri durulayın ve matris de toplamak için bir kazıyıcı (kauçuk polis) kullanın. 5 ml PBS ekleyin. Santrifüj sırasında saymak için bir kısım.
- 5 dakika boyunca 800 g santrifüjleyin.
- Aspire ve 5 'lik bir konsantrasyon için PBS içinde tekrar süspansiyon - 10x 10 6 / ml. Enjekte kadar (30 dakika içinde enjekte) buz üzerinde saklayın.
- 4-5 haftalık kadın bağışıklık eksikliği olan farelerde (örneğin SCID) içeren steril bir kaput içinde bir kafes yerleştirin.
- % 70 etanol ile 4. (karın) meme başı etrafındaki alanı püskürtün.
- Meme yağ yastığı içine 0.1 ml enjekte edilir. Eğer bir asistan, bir kişi bir yerde fare tutabilir, diğer meme yağ yastığı içine iğne ekler. Kendinize enjekte ederek, izofluran kullanarak hafif anestezi altında fare koymak.
- Tümör 5-7 mm büyüdü sonra, Meme Görüntüleme Pencere (MIW) takılmalıdır.
Not: Alternatif olarak, bazı uygulamalar için MIW, sağlıklı meme yağ yastığı üstüne yerleştirilir ve daha sonra hücreler enjekte edilebilir. Bu yaklaşım, fizyolojik bir ortamda geçici transfekte hücreler görüntüleme sağlar.
2. Meme Görüntüleme Pencere (MIW) Manuel imalat:
- MIWs (Şekil 1A) biyouyumluluk garanti doku sınıf plastikten yapılır. Manuel inşaat için, 5 veya 10 cm çanak kullanmanızın.
- Lateks eldiven koyun.
- Bir doku kültürü çanak Isı ve ısıtmalı çanak (Bunun için 1-inç dremmel bit kullanımı) karşı bir yuvarlak, sert bir cisim basarak kavisli bir yüzeye ibaret.
- Merkezi ısıtmalı bir jilet kullanarak çanak kesin.
- Kubbe şeklinde plastik taban (çapı 6-7mm) merkezinde bir delik yapmak için küçük, şeklinde koni dremmel biraz kullanın.
- Dremmel ile kumlama ve daha da dosyalama plastik taban kenarları tamamen düz olun.
- Dosya cam lamel için düz bir yüzeye plastik taban üst. Başvurarak, düz bir yüzey çapı 9-10mm olmalıdır.
- Tutkal superglue kullanarak basık yüzey üzerine 8mm yuvarlak cam lamel (1 numara) (siyanoakrilat yapıştırıcı).
- Kuru tutkal (15 dakika) bekleyin.
- Tabanının içine dışarıdan (cam) delinmesiyle sekiz sütür delik açmak için ısıtmalı bir 26g iğne kullanın. Delikler, lamel kenarından 0,5-1mm uzaklıkta, eşit lamel etrafında dağıtılmış olmalıdır.
- 5-0 sütür iğnesi kullanarak delikler genişletin.
- Plastik tabanı delik delme, iç yüzeyi pürüzlü hale getirecektir. Zımpara kağıdı kullanarak, yüzeyi tamamen düz olun.
- Küçük bir fırça kullanarak MIW küçük plastik parçacıkların eldiven ve fırça değiştirin.
- MIW deiyonize su ile yıkayın.
- % 70 etanol kullanarak MIW yıkayın. Q-ucu tamamen şeffaf cam temizlemek için kullanın. Tutkal buhar sisli lekeler varsa, bir Q-tip ile aseton dikkatli kullanın.
- Yanlardan en az 3 saat süreyle UV ışınlarına maruz kalma MIW sterilize edin.
Meme Görüntüleme Pencere (MIW) Yarı Manuel fabrikasyon
Plastik taban imal etmek için, şu anda silikon kauçuk döküm kalıpları kullanarak el yapımı MIWs kullanarak oluşturdu. Kalıp silikon kauçuk, sonra hemen araya polyester reçine ile doldurulur ve tekrar orijinal ön ve her ikisi de tam bir kopyasını yapmak üzere iki kısımdan oluşur. Sıvı polyester reçine birlikte 09:10 karıştırılır ve sert bir yapı içinde 48 saat içinde tam olarak tedavi sonuçları. Plastik parçalayarak ya da zaman içinde sarı olma UV korumalı ve arşiv.
Sonra, temel tedavi adımları 2,8-2,16 el yapımı MIWs için aynı şekilde yapılır.
3. MIW yerleştirilmesi:
- 4. meme etrafında küçük bir (5-7 mm çapında), tümör hücre tipi (Şekil 1B) bağlı olarak tümör hücrelerinin enjeksiyonu sonrasında birkaç gün / hafta Dendra2 photoswitchable protein veya diğer floresan proteinleri ifade hücre enjeksiyonu kullanılan hücre hattı bağlıdır sonra ne kadar zaman geçti. Gözle görülür nekrotik tümör ve tümörün üstüne saç ile sağlam bir cilde sahip olmalıdır. Nekrotik tümörleri olan farelerin ötenazi olmalı.
- Için steril alanda steril bez hazırlayın steril bir kaput içinde bir parça aşağı cerrahi yatıyordu. G steril bir parçası koyunortasında auze ve onun etrafında bir kaç MIWs ve steril aletler yatıyordu: küçük standart makas, yaylı makas, microdissecting cımbız, microdissecting forseps, iğne tutucu kullanın. Q-ipuçları% 70 etanol ve kaput köşesinde steril eldiven, bir şişe steril tutun.
- Fare HBSS% 2.5 AVERTIN IP enjeksiyon (20 ul / g) kullanarak steril kaput anestezi veya alternatif olarak 10 mikrogram / kg ketamin + 10 mg / g ksilizin (onayları ve sipariş için Hayvan Bakım Enstitüsü ile temas).
Not: Avertin çözüm hazırlanmalıdır iki haftada bir, filtre 0.22 mikron filtre ve 4 500 ul alikotları olarak saklanır kullanarak sterilize ° C (koyu). - Saç, küçük bir hayvan tıraş makinesi kullanarak tümör üzerindeki alana tıraş tarafından çıkarın.
- Nair epilasyon kremi (herhangi bir eczane mevcuttur) kullanarak saç geri kalanı çıkarın. Etanol-daldırma Q-ipuçları kullanarak cilt temizleyin.
- Hayvan steril gazlı bez üzerine aktarın ve kurutma ve enfeksiyon onları tutmak için gözlerine oftalmik merhem uygulayın.
- Betadin ile cilt sterilize ve% 70 etanol ile temizleyin.
- Steril kaput içinde steril cerrahi bir beze hayvan aktarın.
- Cilt, cilt ve kesme ~ 2mm kesi forseps kullanarak meme hemen medial çekin.
- Diseksiyon makas ve forseps kullanarak deri altında yatan meme yağ yastığı ayırın. MIW ekleme ağırlayacak bir boyutu bu ayrılık adım sırasında cilt ve delik streç.
- Yanlışlıkla bir gemi sugery sırasında isabet ederse, üretilen / aşırı haline gelen kanamayı durdurmak için herhangi bir kan kaldırmak için steril bir Q-ipuçlarını kullanın.
- MIW yerinde MIW taban ve sütür üst deri emilmeyen parçacığı kullanarak ve iğne kesme ters olduğu gibi yerleştirin.
- Sütür delikleri doldurmak ve cilde MIW güvenli bir doku yapıştırıcısı veya siyanoakrilat kullanın.
- TMP-SMX antibiyotik karışımı ekleyin: (Sulfamethoxazole 0.6 mg / ml, Trimetoprim 0.12 mg / ml), ameliyat öncesi ve sonrası 3 gün boyunca kafes su şişesi.
- Hayvan AVERTIN IP enjeksiyondan sonra 1-4h anestezi altında kalır. Ameliyat genellikle ~ 45dakika sürer, hayvan daha sonra kurtarmaya yardımcı olması için önemlidir:
- Bir yandan ısıtma yastığı kafesinin altındaki (37 ° C) (eczane mevcut) yerleştirin ve gazlı bez ile örtün.
- Onun mide döner ve yürümeye başlayana kadar yastık üstünde hayvan tutun.
- Hayvan 3h daha fazla bilinçsiz ise, rehidrasyon için 0.3 ml HBSS intraperitoneal enjekte edilir.
- Hayvan sonraki 3-4 gün içinde ilk görüntüleme oturumu gerçekleşmeden önce kurtarmak için izin verilir.
4. Görüntüleme Kutusu İnşaatı
Görüntüleme kutusu MIW mikroskop amacı sağ üstünde, düz oturma olduğunu garanti eder. Ayrıca izofluran sürekli hava akımı sayesinde sıcaklık ve anestezi kontrolünü kolaylaştırır. Kutusu pleksiglas ve plastik kaynak kullanarak birbirine yapıştırılmış. Bu özel mikroskop aşaması için donatılmıştır ve bu yüzden kendi alt şekil (Şekil 2 Leica SP5 mikroskop sahne monte kutu düzenini gösterir) kullanılan mikroskop bağlı olarak değişir.
Santimetre olarak kutu boyutları l = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Şekil 2A). Leica SP5 mikroskop sahne içinde uygun çukur bir tabak, 12.7x8.4 cm boyutunda, ve iki sürgülü "kapılar", dairesel bir açılış (formu 5.7 X 5.7 cm_each, kutunun altındaki oluşur d = 2.22 cm kapatıldığında.) Bu açılış MIW sığar. Ön parça yan parçaları bir vakum yol açan bir çıkış deliği içerir anestezi teslimat için giriş deliği içerir.
Kondansatör ve slayt tutucu görüntüleme kutusu yerleştirme önce kaldırılması gerektiğini unutmayın.
5. Görüntüleme Kutusu kullanın.
- Izofluran ile anestezi altında hayvan koyun ve gözleri oftalmik merhem uygulayın.
- Giriş deliği (Şekil 2B) dışında, anestezi makine görüntüleme kutusu ön izofluran egzoz takın.
- Görüntüleme kutusunun çıkış deliği ikinci bir tüp takın. Bu tüp gaz filtre ve ardından vakum eklenmelidir.
- Kutusunun kapağını açın ve kutusu kapıları açmak ve hayvan, MIW yan bakan alt yerleştirin ve kutuya sürgülü kapılar.
- Kutusunu tutun ve MIW üssüne düzenlenen ve aralarında hareketsiz böylece alt kapı ayarlayabilirsiniz. MIW lamel bu seviyenin altında sadece birkaç milimetre olmalıdır MIW tabanı, görüntüleme kutusu kapıları olarak aynı düzeyde olmalıdır. Alt kapı kutusu paralel sürgülü kapılar alt kenarı arasındaki MIW konumlandırma lamel (MIW cam kısım) düz yatıyor olmasını sağlar emin olun. Bu doğru odaklama sağlayacaktır.
- Kutusunun yerleştirilmesi için uzay izin vermek için, mikroskop hedefi Altmikroskop aşamasının.
- Mikroskop sahnede kutu yerleştirin ve MIW lamel amacı yukarıda böylece sahne ayarlamak.
- Odak amaç ve görüntüleme başlatmak.
- Izofluran kullanırken, hayvan solunum frekansı görsel muayene ile takip edilmelidir. Bu, görsel veya görüntüleme toplama (bu veri toplama ile müdahale) sırasında görünen solunum eserler frekans izleme yapılabilir. MouseOx pulse oksimetre sistemi (Starr yaşam Bilimler Corp) başarıyla kullanılmaktadır. Bu şekilde hayvan kontrol odasında ışıkları dönüm olmadan sürekli veri elde edilebilir.
Not: Her görüntüleme seanstan sonra, hayvan kurtarma, küçük bir gazlı bez ya da Kimwipes el ısıtma yastığı sarma ve hayvan kafesine altına koyarak kolaylaştırılması gerekmektedir.
Not: bir daldırma amacı MIW ile görüntü için kullanılır ise, daldırma orta (gliserol, su, yağ) görüntüleme penceresi temizlenir olmalıdır. MIW görüntüleme sırasında meydana gelmiş olabilecek herhangi bir çatlak ya da diğer hasarlar açısından kontrol edilmelidir. Bu çoklu görüntüleme oturumları sırasında veri toplamak için kritik öneme sahiptir.
6. Dendra2 etiketli hücrelerinin Photoswitching ve görüntüleme
Leica SP5 konfokal mikroskop için prosedürü tarif; optimize etmek için bir rehber olarak kullanılması gereken diğer konfokal mikroskoplar kullanarak veya multiphoton görüntüleme kurarken odak düzlemli lazer gücü, hedefleri ve yazılım seçenekleri değişir ve bu nedenle aşağıda açıklanan protokol mikroskopta deneme.
- Yeşil floresan filtre ile gözmerceği (10x) ile tümör gözlemleyerek, büyük kan damarları gözle görülür bir şekilde akan ve aynı odak düzlemli düz döşeme bulun.
- PMT tespiti için alan ve anahtar merkezi damarlarının bir konum.
- Iki kanal için sıralı görüntüleme toplama ayarlayın. Kanallardan biri 488nm lazer çizgisi (% 10 güç) kullanır ve Dendra2 (505-540nm) yeşil formu ekstrasellüler matriks (480-495nm) ve emisyon saçılma toplar. Ikinci kanal 543nm lazer çizgisi (% 90 güç) kullanır ve Dendra2 kırmızı formu (555-600Nm) emisyon toplar. 3D görüntü ön photoswitching toplayın.
- 405nm lazer çizgisi (% 30 güç, 20-40 taramaları) kullanarak hücrelerin seçilmiş bir nüfus photoswitch ROI tarama seçeneği kullanın. Anahtarlama izlemek için protein kırmızı formu emisyon toplayın.
- 6.3 'de aynı sıralı rutin kullanarak 3 boyutlu görüntüleri, post-anahtarlama toplamak.
- Eğer tümör birden fazla bölge photoswitching, hem yeşil ve kırmızı kanalları (Şekil 3A, B), bir dijital kamerayı kullanarak Okülerin üzerinden fotoğraf çekmek için tavsiye edilir. Bu yönde, daha sonraki görüntüleme oturumları sırasında yardımcı olacaktır.
Not: Ayrıca, kan damarlarının geçici olarak floresan dekstran (Cascade Mavi veya Alexa Fluor 647, hem de 10kDa) kuyruk ven enjeksiyon kullanarak etiketli olabilir. Dextrans enjeksiyon Birkaç saat sonra kan damarları terk ve kalıcı makrofajlar etiket.
Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 3C kan damarı (hiç floresan) göre dikey olarak odaklı bir dikdörtgen photoswitched bölgesi (kırmızı) gösterir. Sigara photoswitched hücrelerin ekstrasellüler matriks saçılma mor, yeşil. Resim dört görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyon Z-ekseni boyunca (20-50 mikron derinliğinde).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
(; JC, JES ve JW CA100324; JvR için U54GM064346 JES CA77522, JC ve BG U54CA126511) Bu çalışma, ABD Savunma Bakanlığı'nın (BG ve DK BC061403 BC075554), ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. D. Entenberg mikroskopi, görüntüleme kutusu ve J. Pollard (Albert Einstein Tıp Koleji) F4/80 antikor üretiminde yardım M. Rottenkolber ile yardım için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
