التحضير للثقافات الجرذ الحصى الدماغ العصبية للتنمية والدراسات الدبقية

Summary

هو وصف لبروتوكولات الدماغ الفئران الجنينية ثقافة النظام الكلي. يمكن الأسلاف Multipotent في المجاميع تطوير وتفرق في الخلايا النجمية ، والخلايا العصبية oligodendrocytes.

Abstract

في المختبر في النظام الذي يلخص تطور وتمايز من الأسلاف إلى الخلايا العصبية الناضجة والدبقية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) سيوفر منصة قوية لعلماء الأعصاب إلى التحقيق الذخائر المتروكة ، الدبقية التفاعلات ، والخصائص وتمايز multipotent الأسلاف ، وتقدم oligodendroglial خلايا النسب على المستوى الخلوي والجزيئي. نحن هنا وصف ثقافة التجميعية CNS النظام من forebrains الفئران الجنينية ، التي يمكن في ظلها في وسط المصل خالية تصل إلى 3-4 أسابيع ، ويستخدم في المختبرات لدينا نموذجا لدراسة الخلايا العصبية ، وتكون الميالين الدبقية تفاعل الجهاز العصبي المركزي. وهذا مقطع فيديو لشرح كيفية عزل وزراعة هذه الثقافات التجميعية CNS من الدماغ الفئران E16. وعلاوة على ذلك ، من تشريح الدماغ نفسه ، يمكن فصلها العادية عالي التخصيب الثقافات الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها بسهولة واستخدامها في الدراسات المختلفة على الخلايا العصبية الجهاز العصبي المركزي أو استخدامها لالثقافات بالتعاون مع الخلايا الأخرى.

Protocol

التحضير قبل التشريح

أدوات جراحية : تعقيم جميع مقص تشريح وملقط بواسطة الأوتوكلاف

ساترة التنظيف :

1. نقع جميع coverslips (15mm في قطر لمدة 24 لوحة رفاه) في دورق العشب 1L في حمض الهيدروكلوريك 33 ٪ على الاقل 24 ساعة
2. تغسل بالماء الجاري لمدة 10 دقيقة مع يهز عرضية لإزالة كل بقايا حمض الهيدروكلوريك
3. الشطف بالماء ميليبور
4. استنزاف المياه قبالة
5. نقع في الإيثانول coverslips 95-98 ٪
6. coverslips نقل إلى الأنسجة نظيفة على لوحة مسطحة والهواء الجاف وcoverslips
7. نقل coverslips إلى الدورق الزجاجي ، مع تغطية احباط الالومنيوم والأوتوكلاف
   ويمكن تخزين Coverslips في هذه المرحلة : مذكرة
8. مكان ساترة الفردية في لوحات الثقافة. جاهزة للطلاء

ساترة طلاء :

1. تمييع الأسهم 100 x من بولي - D - يسين (PDL ، 10 ملغ / مل في المصل البقري بنسبة 0.5 ٪ في الألبومين في برنامج تلفزيوني ، وتخزينها في aliquots -20 درجة مئوية) مع برنامج تلفزيوني وتصفية تعقيم - (0.22 ميكرون)
2. coverslips معطف مع 1 خ حل PDL (~ 0.15 مل / سم ²⁾ لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة
3. إزالة حل PDL وتغسل 3 مرات مع العقيمة O ₂ DDH وcoverslips يجف تماما

ملاحظة : يكفي coverslips المعطف / لوحات لكل تشريح. ويمكن تخزين PDL المغلفة coverslips لبضعة أسابيع في 4 درجات مئوية.

وسائل الاعلام والحلول

تشريح المتوسطة (DM) : استخدام محلول معقم الجليد الباردة هانك في سولت المتوازن (ث / س ^{2 +} الكالسيوم ، المغنيسيوم ^{2 +)} (HBSS ، Invitrogen 14175) تستكمل مع HEPES 10 ملم (Invitrogen 15630).

الثقافة وسائل الإعلام تجميع : والمتوسطة DMEM/NBB27 يحتوي DMEM / Neurobasal (1:1 المجلد : المجلد الأول) ، و 2 ٪ B27 ، 1 × ساتو ، و 0.5 ملي البيروفات الصوديوم ، 0.75mM GlutaMAX ، 60μg/ml ن أسيتيل ، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين ، 10nM د البيوتين و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين. لجعل 100 مل من مستنبت الكلي ، مزيج 50 مل DMEM (ث / س البيروفات / الجلوتامين ، Invitrogen 11960) ، و 50 مل المتوسطة Neurobasal (Invitrogen 211034) ، 375 GlutaMax ميكرولتر (100 س ، Invitrogen 35050) و 5.5 ملغ صوديوم البيروفات (سيغما P2256) ، 2 مل B27 (Invitrogen 17504) و 6.3 ملغ N أسيتيل (سيغما A8199) ، 1 مل من الأسهم ساتو (السهم × 100 ، أنظر أدناه) ، و 25 ميكرولتر من مد البيوتين الأسهم (4000 X الأسهم ، 40 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني كما المخزنة في aliquots -20 درجة مئوية. سيغما B4639) ، و 100 ميكرولتر من الانسولين (1000 × الأسهم ، 5 ملغ / مل في حمض الهيدروكلوريك 0.01N المخزنة على aliquots في -20 درجة مئوية ، سيغما 16634) ، و 1 مل البنسلين / ستربتوميسين (100 × الأسهم ، Invitrogen 15140) ، فلتر تعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية.

ساتو 100 × حل الأسهم : لجعل 40 مل من المخزون : مزيج 40 مل Neurobasal مع 400 ملغ الاشتقاق ترانسفيرين (سيغما T2252) ، 400 ملغ BSA (سيغما A9647) ، و 10 ميكرولتر من هرمون البروجسترون (25 ملغم / لتر من الإيثانول ، كما المخزنة aliquots -20 درجة مئوية في سيغما P8783) ، 64 ملغ بوتريسين (سيغما P7505) ، و 40 ميكرولتر من زيلونيت الصوديوم (30 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني ، وتخزينها في aliquots -20 درجة مئوية ، سيغما S5261). فلتر تعقيم محلول المخزون ساتو ، والمخزن كما aliquots في -20 درجة مئوية.

عصبون المتوسطة الطلاء (بعد الظهر) : متوسطة Neurobasal ، 2 ٪ B27 ، 2mm والجلوتامين (الأسهم 100X ، aliquots المخزنة في -20 درجة مئوية ، Invitrogen 25030) ، 25μM حمض الغلوتاميك (100 الأوراق المالية ، وتخزينها في aliquots -20 درجة مئوية) و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين.

مستنبت الخلايا العصبية (CM) : Neurobasal متوسطة ، و 2 ٪ B27 ، 2mm والجلوتامين (الأسهم 100X ، aliquots المخزنة في -20 درجة مئوية) ، و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين.

5 - FDU المخزون : 100X الأسهم ، 1MM 5 - الفلورية 2' - deoxyuridine (سيغما F0503) and1mM يوريدين (سيغما U3003) في المتوسط ​​Neurobasal. تصفية وتعقيم وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية.

غراء حل الهضم (قبل إجراء تشريح جديد) :

1. حل L - 3.2 ملغ سيستين (سيغما C - 7352) في بلدية دبي 4ml
2. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى حوالي 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم 1N (اختبار على شرائط اختبار pH) ووضعه في حمام الماء عند 37 درجة مئوية
   ملاحظة : نفذ الخطوة التالية مباشرة قبل هضم الأنسجة (أنظر أدناه).
3. غراء إضافة إلى التركيز النهائي من 20 وحدة / مل
4. فلتر تعقيم (0.22mm) ، ووضعه في حمام الماء عند 37 درجة مئوية

التربسين حل المانع (جعل الطازجة قبل التشريح) :

1. حل 0،2 ز مثبط التربسين (سيغما T7295) في بلدية دبي 20ml
2. فحص وضبط درجة الحموضة الحموضة إلى ~ 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم N 1
3. فلتر تعقيم ، ووضعه في حمام الماء عند 37 درجة مئوية

تشريح الدماغ

الإعداد :

• ملقط معقم والمقص
• 70 ٪ من الإيثانول
• المناديل الورقية النظيفة وdiapإيه سادة على مقاعد البدلاء
• أطباق بتري 10cm مع الثلج الباردة مارك ألماني للالرحم والجنين على مقاعد البدلاء
• منصة الجليد في تشريح المجهر
• 2-3 أطباق 6cm مع بلدية دبي على الجليد
• الحارة PM في حمام مائي 37 ° C

1. الموت ببطء ، حامل سبراغ داولي (E16) وفقا للإجراءات التي وافقت عليها رعاية الحيوان الخاص بنا المؤسسية واللجنة (IACUC)
2. وضع فأر على منصة حفاضات والكحول التعقيم على منطقة البطن
3. استخدام ملاقط لعقد جلد البطن ومقصا لإجراء شق شكل V فقط قطع الجلد
4. وبصرف النظر انتشار الجلد واستخدام آخر ملاقط معقمة والمقص لقطع طريق طبقة العضلات
5. استخراج سلسلة من الحويصلات الجنين وتحويلها الى صحن يحتوي على 10cm الجليد الباردة DM
6. باستخدام مقص microdissection ، إزالة الجنين بعناية كل من الكيس والدماغ من كل الأجنة ، ومكان تحرير العقول في طبق 10cm نظيفة مع بلدية دبي على منصة الجليد
7. في هود رقائقي وتحت مجهر التشريح ، وإزالة المخ الأوسط / أقسام الدماغ المؤخر ، واستخدام الملقط لإزالة غرامة السحايا ، ونقل قشرات تنظيفها / الحصين لطبق 6cm جديدة مع بلدية دبي على وضع كيس من الثلج
   ملاحظة : في هذه المرحلة ، والأنسجة مستعدة لهضم الانزيم.
8. جعل غراء ومثبط التربسين حل وتصفية تعقيم
9. إزالة الزائدة من القشور DM / الحصين
10. إضافة 4ml من الحل غراء هضم المعدة
11. نقل كافة المحتويات إلى أنبوب 50ml ووضع أنبوب فالكون في حمام الماء عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق بالضبط
12. إزالة غراء حل مع ماصة
13. إضافة 5ml حل مثبط التربسين ، دوامة الأنبوب ، ووضع في حمام الماء عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة
14. إزالة مثبط التربسين الحل
15. كرر الخطوة 13 و 14 ثلاث مرات
16. إضافة PM دافئة 20ml
17. يسحن حتى اختفت جميع كتل (~ 20-30 مرات)
18. الطرد المركزي في ل100xg 7min
19. وبيليه في Resuspend PM 10ML ويغسل مرتين بواسطة الطرد المركزي
20. Resuspend الكرية PM 10ML في الخلايا العصبية للثقافات العادية أو في NBB27/DMEM الكلي للثقافات
21. تمر الخلايا من خلال غرابيل الخلية 70μm
22. عد الخلايا الحية
23. انتقل إلى الثقافات الكلي كما هو موضح أدناه أو لوحة الخلايا العصبية العادية للثقافات
    ملاحظة : في هذه الخطوة ، لا يمكن أن يتحقق التخصيب الثقافات الخلايا العصبية بواسطة الطلاء على فصل الخلايا PDL طلاء لوحات في كثافة 200-640 خلية / مم ² تبعا للغرض من التجارب. بعد الخلايا قد تعلق (~ 2 - 4H) ، يستعاض عن المتوسط ​​مع رئيس الوزراء الدافئة. إذا زرع لفترات طويلة من الزمن ، في يوم 4 ، يستعاض عن نصف المتوسط ​​الدافئة مع CM. ويمكن لتخصيبه بدرجة الثقافات العصبية ، مثبط الإنقسامية تضاف 5 - FDU (تركيز النهائي 10 ميكرومتر) في DIV2 لمنع انتشار الخلايا العصبية غير الخلية (أي خلال 3 DIV2). بعد الانتعاش في CM ل 2 أيام ، هي نبض تعامل الخلايا مرة أخرى مع FDU - 5 أيام أخرى 2 (DIV 6-7) ، يليه تغيير المتوسطة كاملة. بعد ذلك ، يستعاض عن نصف المتوسط ​​مع CM ، طازجة حارة كل 3-4 أيام. الخلايا العصبية قابلة للبقاء لمدة تصل إلى 4 أسابيع.

المجاميع التحضير والطلاء

1. تعليق فصل الخلايا التي تحتوي في المتوسط ​​NBB27/DMEM 1X ساتو ، وCNTF 10ng/ml forskolin 10μM في مناطق ذات كثافة الخلايا 2x10 ⁶ / مل
2. نقل 2ml من تعليق خلية في كل جانب من لوحة غير المصقول جيدا 6
3. الثقافة لمدة 3 ليال. كل يوم ، resuspend برفق باستخدام خلايا مرة واحدة في Pipetman P1000
   ملاحظة : تبدأ الخلايا لتكوين الحصى (الشكل 1).
4. في اليوم قبل الطلاء الكلي ، ومعطف لوحة / coverslips مع Matrigel :
   • تمييع الأسهم Matrigel (عامل النمو المنخفض ، العلوم البيولوجية دينار بحريني 354230) 01:20 مع DMEM الباردة على الجليد
     ملاحظة : يجب أن نكون مستعدين لكل بروتوكول aliquots Matrigel المصنعة. جميع نصائح ، ينبغي أنابيب إيبندورف والحلول لصنع aliquots للسهم تكون باردة لتجنب البلمرة Matrigel. يتم الاحتفاظ Aliquots من Matrigel في -80 درجة مئوية ودرجة مئوية في إذابة 4
   • معطف سابقا PDL المغلفة coverslips مع 300μl/well من الحل Matrigel المخفف بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية
   • يغسل مع PBS الدافئ ، ثم تغسل مع لوحة الدافئة المعقمة O ₂ DDH وترك لوحات في الحاضنة.
5. 3 أيام بعد تشكيل الكلي ، resuspend بلطف خلايا مرة أخرى وغربال تعليق من خلال شبكة 200μm في أنبوب فالكون 50ml. المجاميع يسمح لتستقر في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية (~ 3 - 5min)
6. إزالة بعناية طاف
7. إضافة المتوسطة ، resuspend بلطف المجاميع والسماح لهم تسوية مرة أخرى. كرر هذا الإجراء عدة مرات لإزالة الخلايا الميتة والخلايا الفردية والحطام. استخدام المجهر لمعرفة ما إذا كانت لا تزال تحتوي على طاف غير مجمعة الخلايا وdebriق
8. resuspend بلطف المجاميع في المتوسط ​​NBB27/DMEM نفسه (الشكل 1) وعدد المجاميع
9. ضبط كثافة المجاميع الى نحو 25-30 aggreggats/50ul
10. aliquots نقل (500 1000μl) من التعليق الكلي لأنابيب إيبندورف 2ml للتصفيح
    ملاحظة : منذ المجاميع تميل ليستقر في الجزء السفلي من الأنابيب ، من الأهمية بمكان لجعل الأنابيب متعددة من التعليق الكلي لطلاء. resuspend بلطف المجاميع غالبا ما قبل البذر لهم على coverslips المغلفة أو لوحات الثقافة لضمان عدد مماثل من المجاميع مطلي على كل ساترة.
11. تأخذ بها لوحة الثقافة التي تحتوي على Matrigel المغلفة coverslips من الحاضنة. إزالة حل من كل جانب ، وغسل coverslips مع PBS دافئة وDDH O ₂ ، ثم لفترة وجيزة الجافة. وهم الآن على استعداد لزرع الكلي
12. عكس أنبوب يحتوي على تعليق التجميعية السماح بتوزيعها بالتساوي قبل البذر. تحميل 50μl الوقف الكلي في مركز كل ساترة ، ووضع لوحة بلطف العودة إلى الحاضنة دون أي اضطرابات أخرى للسماح لمجاميع نعلق بالتساوي إلى ساترة
    ملاحظة : إن كثافة المجاميع أمر بالغ الأهمية. إذا المصنف المجاميع قريبة جدا من بعضها البعض أو إذا كثافة عالية البذر ، فإنها تميل إلى دمج معا لأنها تنمو.
13. إضافة DMEM/NBB27medium إضافية (500 ميكرولتر) إلى كل ح 4-6 أيضا في وقت لاحق أو في وقت مبكر من صباح اليوم التالي
14. للحفاظ على الثقافة التجميعية ، وتغير نصف المتوسط ​​كل 3-4 أيام. عندما تغير المتوسط ​​، يجب الحرص على عدم تعطيل المجاميع ويتم ذلك عن طريق إضافة بلطف المتوسط ​​على طول الجدار الجانبي من البئر.
    ملاحظة : بعد ساعات قليلة من المجاميع التي تعلق على لوحة ، ويمكن ملاحظة ثمرة neurite من الركام. المحاور تنمو بسرعة في الأسبوعين الأولين وشكل اتصالات وفيرة بين المجاميع (الشكل 2). الأسلاف الدبقية ترحيل شعاعيا للخروج من الركام والتفريق على مر الزمن في الخلايا النجمية وoligodendrocytes ناضجة.

الشكل 1. الصور النقيض من الخلايا التي تشكل المرحلة المجاميع في أيام مختلفة والركام بعد الغسيل.

الرقم المقابل المرحلة 2. الصور ثقافة الكلي (2) وبعد 12 يوما على المصنف Matrigel المغلفة coverslips.

Discussion

أفادت دراسات مبكرة وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الميلين ناضجة في تناوب بوساطة مجانا الثقافات التجميعية العائمة ^1. ثقافة التجميعية CNS نظام يجمع بين مصل وصفها هنا خالية من نمو الخلايا الاصلية في ثلاث مجاميع multipotent الأبعاد مع راحة الثقافات 2D التقليدية لتسهيل التحليلات الهجرة الخلية ، والتنمية والتمايز في المختبر ، ويمكن تعديل هذا النظام والسلائف المستخدمة في العصبية أبحاث الخلايا والمطالبة بالتحقيق في الخلايا العصبية ، الدبقية التفاعلات. على سبيل المثال ، وخلايا معدلة وراثيا مثل أسلاف oligodendrocyte ² قد تضاف إلى مجموع الثقافات. يمكن أن يكون تأثير الخلايا المناعية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة أو الكواشف مختلفة على التنمية والتفريق بين الخلايا العصبية والدبقية درس أيضا. وقد تم مؤخرا Reaggregates تنقيته من خلايا الشبكية العقدة تستخدم لدراسة الجهاز العصبي المركزي تكون الميالين في cocultures مع oligodendrocytes في غياب الخلايا الأخرى ^3. في اتفاق مع التقرير السابق ⁴ ، Matrigel يبدو أن تتفوق على PDL لأنه يعزز التصاق الخلايا ويسرع نمو وتمايز neurite الدبقية. ولذلك يستخدم Matrigel كما التحتية بالنسبة للمجاميع خلية في هذا البروتوكول.