चूहा न्यूरॉन Glia और विकास अध्ययन के लिए मस्तिष्क सकल संस्कृति की तैयारी

Summary

एक भ्रूण चूहा मस्तिष्क कुल संस्कृति प्रणाली के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है. समुच्चय में multipotent progenitors विकास और न्यूरॉन्स astrocytes, और oligodendrocytes में अंतर कर सकते हैं.

Abstract

एक में इन विट्रो प्रणाली है कि recapitulates और परिपक्व न्यूरॉन्स और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में glia (सीएनएस) में progenitors के विकास भेदभाव neuroscientists के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करने के लिए AXO glial बातचीत, गुण और multipotent progenitors के भेदभाव, और oligodendroglial की प्रगति की जांच होगी वंश सेलुलर और आणविक स्तर पर कोशिकाओं. हम यहाँ भ्रूण चूहे forebrains, जो एक सीरम मुक्त माध्यम में बनाए रखा जा सकता है 3-4 सप्ताह के लिए और न्यूरॉन glia बातचीत और सीएनएस myelination अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है से एक सीएनएस कुल संस्कृति प्रणाली का वर्णन. इस वीडियो क्लिप में प्रदर्शन करेंगे कैसे अलग और E16 चूहे के मस्तिष्क से इन सीएनएस कुल संस्कृतियों के विकास. इसके अलावा, एक ही मस्तिष्क विच्छेदन से अत्यधिक समृद्ध नियमित रूप से dissociated neuronal संस्कृतियों आसानी से हो सकता है और प्राप्त कर सकते हैं विभिन्न अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया CNS न्यूरॉन्स पर या अन्य कक्षों के साथ सह - संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया.

Protocol

विच्छेदन से पहले तैयार

सर्जिकल उपकरण: आटोक्लेव द्वारा सभी विच्छेदन कैंची और संदंश बाँझ

Coverslip सफाई:

1. 1L 33% एचसीएल में घास बीकर में कम से कम 24 घंटे के लिए सभी coverslips (24 अच्छी तरह से थाली के लिए व्यास में 15mm) भिगोएँ
2. 10 मिनट के लिए पानी कभी कभी हिला के साथ सभी अवशिष्ट एचसीएल हटायें चल साथ धो
3. Millipore पानी से कुल्ला
4. पानी नाली बंद
5. 95-98% इथेनॉल में coverslips भिगोएँ
6. एक फ्लैट प्लेट और हवा पर स्थानांतरण एक स्वच्छ ऊतकों को coverslips सूखी coverslips
7. एक गिलास बीकर coverslips स्थानांतरण, के साथ कवर एल्यूमीनियम पन्नी और आटोक्लेव
   नोट: Coverslips इस स्तर पर भंडारित किया जा सकता है
8. संस्कृति प्लेटों में व्यक्तिगत coverslip रखें. कोटिंग के लिए तैयार

Coverslip कोटिंग:

1. 100 पाली-D-lysine के x पीबीएस और फिल्टर बाँझ (0.22 सुक्ष्ममापी) (PDL, 10 मिलीग्राम / एमएल 0.5% गोजातीय पीबीएस में albumin सीरम में -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots के रूप में संग्रहीत) के साथ शेयर पतला
2. 2 घंटे के लिए 1 x PDL (~ 0.15 मिलीग्राम ^{/ 2} सेमी) 37 ° समाधान एक इनक्यूबेटर में सी के साथ कोट coverslips
3. PDL समाधान निकालें और पूरी तरह से बाँझ DDH ₂ हे और सूखी coverslips के साथ 3 बार धोने

नोट: पर्याप्त coverslips / प्रत्येक विच्छेदन के लिए प्लेटें कोट. PDL - लेपित coverslips 4 पर एक कुछ हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता डिग्री सेल्सियस

मीडिया और समाधान

विच्छेदन (डीएम) मध्यम: बाँझ बर्फ ठंड हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (w / ओ ² Ca ^{+ 2} मिलीग्राम ⁺⁾ का उपयोग करें (HBSS, 14175 Invitrogen) 10 मिमी HEPES (15,630 Invitrogen) के साथ पूरक.

सकल संस्कृति मीडिया:, B27-2%, 1 x Sato, 0.5 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 0.75mM GlutaMAX, 60μg/ml एन एसिटाइलसिस्टीन, 5 / μg मिलीलीटर: DMEM/NBB27 मध्यम / DMEM Neurobasal (खंड 01:01 खंड) शामिल इंसुलिन, घ बायोटिन 10nm और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन. कुल मध्यम संस्कृति के 100 मिलीलीटर, 50 मिलीलीटर (w / ओ पाइरूवेट / glutamine, Invitrogen 11960) DMEM, 50 मिलीलीटर Neurobasal मध्यम (211,034 Invitrogen), 375 μl GlutaMax (100 x, Invitrogen 35050), 5.5 मिलीग्राम सोडियम पाइरूवेट मिश्रण (P2256 सिग्मा), 2 B27 मिलीलीटर (17,504 Invitrogen), 6.3 मिलीग्राम एन एसिटाइलसिस्टीन (A8199 सिग्मा), Sato स्टॉक के 1 मिलीग्राम (100 x शेयर, नीचे देखें), D-बायोटिन स्टॉक (4000 x स्टॉक, 40 के 25 μl पीबीएस में सुक्ष्ममापी पर aliquots -20 ° सी. सिग्मा B4639), इंसुलिन की 100 μl (1000 x शेयर, 5 मिग्रा / एमएल -20 पर 0.01N एचसीएल में aliquots के रूप में संग्रहीत ° सी, सिग्मा १६६३४), और 1 मिलीलीटर पेनिसिलिन के रूप में संग्रहीत / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 x शेयर, Invitrogen 15140), फिल्टर बाँझ और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस

100 Sato एक्स शेयर समाधान: शेयर की 40 मिलीलीटर: मिश्रण 40 मिलीलीटर के साथ 400 APO transferrin (T2252 सिग्मा) मिलीग्राम, 400 मिलीग्राम (A9647 सिग्मा) BSA, progesterone के 10 μl (25 इथेनॉल मिलीग्राम / एमएल, के रूप में संग्रहीत Neurobasal पर aliquots -20 ° सी. सिग्मा P8783), 64 मिलीग्राम putrescine (P7505 सिग्मा), और सोडियम selenite (पीबीएस में 30 सुक्ष्ममापी, -20 पर aliquots के रूप में संग्रहीत ° सी, सिग्मा S5261) के 40 μl. -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots के रूप में Sato शेयर समाधान है, और दुकान बाँझ फ़िल्टर

न्यूरॉन चढ़ाना मध्यम (प्रधानमंत्री): Neurobasal मध्यम, 2% B27, 2mm Glutamine (100x शेयर -20 ° सी, Invitrogen 25030 पर संग्रहीत aliquots), 25μM glutamic एसिड (100 शेयर -20 ° सी में संग्रहीत aliquots) और 1% / पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन.

न्यूरॉन संस्कृति मध्यम (मुख्यमंत्री): Neurobasal मध्यम, 2% B27, 2mm (100x शेयर -20 ° सी में संग्रहीत aliquots) Glutamine और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन.

5 FdU शेयर: Neurobasal माध्यम से शेयर 100x, 1mm 5-fluoro 2'deoxyuridine (F0503 सिग्मा) and1mM uridine (U3003 सिग्मा). फ़िल्टर निष्फल और -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots के रूप में संग्रहीत

Papain पाचन समाधान (पहले विच्छेदन के लिए ताजा):

1. डीएम 4ml में 3.2 मिलीग्राम एल Cysteine ​​(सिग्मा सी - 7352) भंग
2. पीएच 7.4 चारों ओर 37 में 1N NaOH (पीएच परीक्षण स्ट्रिप्स पर परीक्षण) और पानी के स्नान में जगह के साथ समायोजित डिग्री सेल्सियस
   नोट: सही ऊतक पाचन से पहले अगले कदम प्रदर्शन (नीचे देखें).
3. 20 यूनिट / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता papain जोड़ें
4. बाँझ फ़िल्टर (0.22mm), और पानी के स्नान में 37 जगह पर डिग्री सेल्सियस

Trypsin अवरोध करनेवाला समाधान (पहले विच्छेदन के लिए ताजा):

1. 0.2 20ml डीएम में छ trypsin अवरोध करनेवाला (T7295 सिग्मा) भंग
2. पीएच की जाँच करें और 7.4 ~ एन 1 NaOH के साथ पीएच को समायोजित
3. बाँझ फ़िल्टर, और पानी के स्नान में 37 जगह पर डिग्री सेल्सियस

मस्तिष्क विच्छेदन

सेटअप:

• निष्फल संदंश और कैंची
• 70% इथेनॉल
• साफ टिशू पेपर और diapबेंच पर एर पैड
• ठंडा और बेंच पर गर्भाशय भ्रूण के लिए डीएम के साथ 10cm पेट्री डिश
• विच्छेदन खुर्दबीन पर बर्फ मंच
• डीएम के साथ बर्फ पर 2-3 6cm व्यंजन
• एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म PM

1. एक गर्भवती Sprague-Dawley अपने संस्थागत पशु की देखभाल द्वारा अनुमोदित प्रक्रिया के अनुसार (E16) चूहा और हमसे समिति (IACUC) euthanize
2. पेट क्षेत्र पर डायपर पैड और बधिया करना शराब पर चूहे लेटाओ
3. पेट की त्वचा और कैंची की एक जोड़ी पकड़ के लिए एक वी आकार चीरा केवल त्वचा में कटौती कर चिमटी का प्रयोग करें
4. अलग त्वचा बिखरा हुआ है और दूसरे निष्फल चिमटी और कैंची का उपयोग करने के लिए मांसपेशियों की परत के माध्यम से कटौती
5. भ्रूण थैलियों की श्रृंखला निकालें और उन्हें एक 10cm पकवान युक्त बर्फ के ठंडे डीएम में स्थानांतरित
6. एक microdissection कैंची का प्रयोग, ध्यान और प्रत्येक भ्रूण से मस्तिष्क थैली से प्रत्येक भ्रूण निकालने के लिए, और जगह में एक बर्फ मंच पर डीएम के साथ एक स्वच्छ 10cm पकवान दिमाग मुक्त
7. लैिमनार हुड में और एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे, midbrain / hindbrain वर्गों को हटाने, और ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए meninges हटायें, और एक आइस पैक पर डीएम के साथ एक नए 6cm पकवान साफ ​​cortices / हिप्पोकैम्पस हस्तांतरण
   नोट: इस स्तर पर, ऊतक एंजाइम पाचन के लिए तैयार है.
8. Papain और trypsin अवरोध करनेवाला समाधान और फिल्टर बाँझ बनाएं
9. Cortices से डीएम अधिक / hippocampi निकालें
10. तैयार papain पाचन समाधान के 4ml जोड़ें
11. स्थानांतरण एक 50ml ट्यूब के लिए सभी सामग्री और एक पानी के स्नान में 37 फाल्कन ट्यूब जगह डिग्री सेल्सियस ठीक 5 मिनट के लिए
12. विंदुक के साथ papain समाधान निकालें
13. 2-3 मिनट के लिए 5ml trypsin अवरोध करनेवाला समाधान, ट्यूब ज़ुल्फ़, और एक पानी के स्नान में 37 में जगह ° सी जोड़ें
14. Trypsin अवरोध करनेवाला समाधान निकालें
15. 13 कदम है और 14 तीन बार दोहराएँ
16. 20ml गर्म PM जोड़ें
17. Triturate जब तक सभी clumps (~ 20-30 बार) गायब हो गया है
18. 7min लिए 100xg पर अपकेंद्रित्र
19. गोली में 10ml PM Resuspend और centrifugation द्वारा दो बार धोने
20. नियमित न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए या कुल संस्कृतियों के लिए NBB27/DMEM में 10ml में गोली PM Resuspend
21. 70μm सेल sieves के माध्यम से कोशिकाओं दर्रा
22. जीवित कोशिकाओं गिन लो
23. कुल संस्कृतियों के लिए आगे बढ़ें के रूप में नीचे वर्णित या थाली नियमित रूप से न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए कोशिकाओं
    नोट: इस चरण में, अत्यधिक समृद्ध न्यूरॉन संस्कृतियों में 200-640 सेल / मिमी के घनत्व पर PDL कोटिंग प्लेटों पर अलग कोशिकाओं ^{चढ़ाना} 2 प्रयोगों के उद्देश्य पर निर्भर करता है के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. बाद कोशिकाओं (~ 2 - 4) संलग्न है, गर्म PM साथ मध्यम जगह. यदि समय की विस्तारित अवधि 4 दिन के लिए संवर्धन, गर्म मुख्यमंत्री के साथ मध्यम के आधे की जगह. अत्यधिक neuronal संस्कृतियों, mitotic अवरोध करनेवाला शुद्ध करने के लिए 5 FdU (अंतिम एकाग्रता 10 सुक्ष्ममापी) DIV2 पर जोड़ा जा कर सकते हैं (DIV2-3 के दौरान यानी,) गैर neuronal सेल प्रसार रोकना. 2 दिनों के लिए मुख्यमंत्री में वसूली के बाद, कोशिकाओं नाड़ी 5 - FdU के साथ फिर से एक और 2 (6-7 DIV) दिन एक पूरा मध्यम परिवर्तन द्वारा पीछा के लिए इलाज किया. इसके बाद, ताजा, गर्म हर 3-4 दिनों मुख्यमंत्री के साथ मध्यम के आधे की जगह. न्यूरॉन्स 4 सप्ताह के लिए व्यवहार्य हैं.

समुच्चय तैयारी और चढ़ाना

1. NBB27/DMEM मध्यम में dissociated कोशिकाओं 2x10 ⁶ कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व 1x Sato, 10ng/ml CNTF और 10μM forskolin युक्त निलंबित
2. एक uncoated 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में सेल निलंबन के 2ml स्थानांतरण
3. 3 रातों के लिए संस्कृति. प्रत्येक दिन, धीरे से एक बार एक P1000 Pipetman का उपयोग कोशिकाओं resuspend
   नोट: कक्ष समुच्चय (चित्रा 1) के रूप में शुरू करते हैं.
4. कुल चढ़ाना पहले दिन, कोट थाली / Matrigel के साथ coverslips:
   • शेयर (वृद्धि कारक कम, बी.डी. बायोसाइंसेज 354230) के साथ बर्फ पर ठंड DMEM 1:20 Matrigel पतला
     नोट: Matrigel aliquots निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए. सभी सुझावों, Eppendorf ट्यूब और शेयर की aliquots बनाने के लिए समाधान Matrigel polymerization से बचने के लिए ठंडा होना चाहिए. Matrigel के Aliquots -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर thawed
   • कोट पहले पतला Matrigel एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रातोंरात समाधान के PDL लेपित 300μl/well के साथ coverslips
   • धो गर्म पीबीएस के साथ, तो गर्म बाँझ _{DDH 2} हे के साथ थाली धोने और इनक्यूबेटर में छोड़ प्लेटें.
5. कुल गठन के बाद 3 दिन, धीरे कोशिकाओं फिर resuspend और चलनी एक 50ml फाल्कन ट्यूब में एक 200μm जाल के माध्यम से निलंबन. समुच्चय गुरुत्वाकर्षण (~ 3-5min) द्वारा ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें
6. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटायें
7. मध्यम जोड़ें, धीरे समुच्चय resuspend और उन्हें फिर से व्यवस्थित है. इस कार्यविधि दोहराएँ कई बार मृत कोशिकाओं, व्यक्तिगत कोशिकाओं और मलबे को हटाने. माइक्रोस्कोप का उपयोग करें करने के लिए जाँच है कि क्या अभी भी सतह पर तैरनेवाला गैर एकत्रित कोशिकाओं और debri होतेएस
8. धीरे एक ही NBB27/DMEM माध्यम में समुच्चय (चित्रा 1) resuspend और समुच्चय गिनती
9. 25-30 के आसपास aggreggats/50ul समुच्चय के घनत्व को समायोजित करें
10. कुल निलंबन के स्थानांतरण (500 1000μl) चढ़ाना के लिए 2ml Eppendorf ट्यूबों aliquots
    नोट: चूंकि समुच्चय ट्यूबों के नीचे बसने की संभावना है, यह चढ़ाना के लिए कुल निलंबन के कई ट्यूबों बनाने के लिए महत्वपूर्ण है. धीरे अक्सर उन्हें लेपित coverslips या संस्कृति प्लेटों पर बोने के लिए प्रत्येक coverslip पर मढ़वाया समुच्चय के समान संख्या सुनिश्चित करने के पहले समुच्चय resuspend.
11. संस्कृति इन्क्यूबेटर से Matrigel - लेपित coverslips युक्त थाली ले लो. प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान निकालें, गर्म पीबीएस और DDH ₂ हे के साथ coverslips धोने, और तब शुष्क संक्षिप्त . अब वे कुल बोने के लिए तैयार हैं
12. कुल निलंबन युक्त उन्हें बोने से पहले होने के लिए समान रूप से वितरित की अनुमति ट्यूब उलटें. प्रत्येक coverslip के केंद्र में कुल निलंबन की 50μl लोड, और धीरे थाली वापस समुच्चय समान रूप से coverslip को संलग्न करने के लिए अनुमति देने के किसी भी आगे की अशांति के बिना इनक्यूबेटर डाल
    नोट: समुच्चय के घनत्व महत्वपूर्ण है. यदि समुच्चय वरीयता प्राप्त हैं भी एक दूसरे के करीब या यदि बोने घनत्व अधिक है, वे एक साथ विलय के रूप में वे विकसित करते हैं.
13. प्रत्येक अच्छी तरह से 4-6 घंटे के लिए अतिरिक्त DMEM/NBB27medium (500 μl) बाद में या अगली सुबह जोड़ें
14. कुल संस्कृति को बनाए रखने के लिए, आधा हर 3-4 दिनों मध्यम बदल. जब मध्यम परिवर्तन, समुच्चय को बाधित नहीं सावधान रहना है और यह अच्छी तरह से की ओर दीवार के साथ धीरे मध्यम जोड़कर किया जाता है.
    नोट: थाली करने के लिए संलग्न समुच्चय के बाद कुछ घंटे, समुच्चय से neurite परिणाम देखा जा सकता है . Axons पहले दो हफ्तों में तेजी से बढ़ने और समुच्चय (चित्रा 2) के बीच में प्रचुर मात्रा में कनेक्शन फार्म. Glial progenitors समुच्चय के बाहर त्रिज्यात विस्थापित और astrocytes और परिपक्व oligodendrocytes में समय के साथ अंतर.

चित्रा 1 चरण धोने के बाद अलग अलग दिनों और समुच्चय में समुच्चय के गठन की कोशिकाओं के विपरीत छवियाँ.

चित्रा 2 और 12 दिनों के Matrigel लेपित coverslips पर वरीय बाद एक समग्र संस्कृति के 2 चरण विपरीत छवियाँ .

Discussion

प्रारंभिक अध्ययन synapses और रोटेशन की मध्यस्थता मुक्त अस्थायी कुल ¹ संस्कृतियों में परिपक्व माइलिन के गठन की सूचना दी. सीएनएस कुल संस्कृति यहाँ वर्णित प्रणाली पारंपरिक 2d संस्कृतियों की सुविधा के लिए सेल विकास, प्रवास, और इन विट्रो में भेदभाव के विश्लेषण की सुविधा के साथ तीन आयामी समुच्चय में सीरम मुक्त multipotent पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के विकास को जोड़ती प्रणाली और संशोधित किया जा सकता है तंत्रिका अग्रदूत के लिए इस्तेमाल किया. सेल और न्यूरॉन glia बातचीत में जांच के लिए अनुसंधान. उदाहरण के लिए, oligodendrocyte progenitors के रूप में आनुवंशिक रूप से संशोधित ^{कोशिकाओं} 2 कुल संस्कृतियों के लिए जोड़ा जा सकता है. Microglia और मैक्रोफेज या न्यूरॉन्स और glia के विकास और भेदभाव पर विभिन्न अभिकर्मकों के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रभाव का भी अध्ययन किया जा सकता है. शुद्ध रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के Reaggregates हाल ही में अन्य ³ कोशिकाओं के अभाव में oligodendrocytes साथ cocultures में सीएनएस myelination अध्ययन इस्तेमाल किया गया है . पिछले ⁴ रिपोर्ट के साथ समझौते में, Matrigel PDL में है कि यह कोशिका आसंजन को बढ़ावा देता है और neurite परिणाम और glia भेदभाव accelerates है बेहतर प्रतीत होता है. Matrigel इसलिए इस प्रोटोकॉल में सेल समुच्चय के लिए बुनियाद के रूप में प्रयोग किया जाता है.