הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה

Summary

פרוטוקולים עבור מערכת עובריים במוח חולדה המצרפי תרבות מתואר. אבות multipotent ב אגרגטים יכול לפתח להתמיין נוירונים, האסטרוציטים ו oligodendrocytes.

Abstract

במערכת במבחנה כי משחזר את התפתחות והתמיינות של אבות לתוך נוירונים בוגרים ו גליה במערכת העצבים המרכזית (CNS) תספק פלטפורמה חזקה עבור מדעני מוח כדי לחקור axo-גליה אינטראקציות, תכונות והבחנה של אבות multipotent, והתקדמות של oligodendroglial שושלת התאים ברמה תאית ומולקולרית. אנו מתארים כאן CNS תרבות המצרפי המערכת forebrains עוברי חולדה, אשר יכול להישמר בכל מדיום בסרום חופשי עד 3-4 שבועות, והוא משמש במעבדה שלנו כמודל ללמוד נוירון, גליה אינטראקציה myelination CNS. זה סרטון תדגים כיצד לבודד ולגדל אלה CNS תרבויות המצרפי מהמוח E16 חולדה. יתר על כן, מן לנתיחה אותו מוח, מועשר תרבויות קבוע העצבית ניתק ניתן להשיג בקלות המשמש במחקרים שונים על נוירונים במערכת העצבים המרכזית או המשמש שיתוף תרבויות עם תאים אחרים.

Protocol

הכנה לפני הניתוח

כלים כירורגיים: לעקר כל מספריים לנתיחה ו מלקחיים על ידי החיטוי

Coverslip ניקוי:

1. משרים את כל coverslips (15mm בקוטר של צלחת 24 היטב) בכוס 1L הדשא HCl 33% לפחות במשך 24 שעות
2. לשטוף עם מים זורמים במשך 10 דקות עם לנער מדי פעם כדי להסיר את כל שיירי HCl
3. לשטוף עם מים Millipore
4. מסננים את המים
5. משרים coverslips באתנול 95-98%
6. Coverslips העברה רקמות נקייה על צלחת שטוחה אוויר יבש coverslips
7. העברת coverslips אל כוס זכוכית, מכסים ברדיד אלומיניום החיטוי
   הערה: Coverslips יכול להיות מאוחסן בשלב זה
8. המקום coverslip הפרט לתוך צלחות תרבות. מוכן לציפוי

Coverslip ציפוי:

1. מדולל x 100 מניות של פולי-D-ליזין (PDL, 10 מ"ג / מ"ל ​​בסרום שור 0.5% אלבומין PBS, מאוחסנים aliquots ב -20 ° C) עם PBS ולסנן-לעקר (0.22 מיקרומטר)
2. מעיל coverslips עם פתרון 1 PDL x (~ 0.15 מ"ל / ס"מ ²⁾ עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור
3. הסר פתרון PDL ולשטוף 3 פעמים עם סטרילי DDH ₂ O ו coverslips להתייבש לחלוטין

הערה: סמל מספיק coverslips / צלחות עבור כל לנתיחה. PDL מצופה coverslips יכול להיות מאוחסן במשך כמה שבועות ב 4 ° C.

מדיה ופתרונות

בינוני Dissection (DM): השתמש תמיסת מלח סטרילית מאוזן קרים של האנק (w / o Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} (HBSS, Invitrogen 14,175) בתוספת 10 HEPES מ"מ (Invitrogen 15,630).

תרבות התקשורת צבירה: בינוני DMEM/NBB27 מכיל DMEM / Neurobasal (1:1 כרך: כרך א), 2% B27, 1 x סאטו, נתרן pyruvate 0.5 מ"מ, 0.75mM GlutaMAX, 60μg/ml N-acetylcysteine, 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 10nm d-ביוטין ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. כדי להפוך את 100 מ"ל של המדיום תרבות צבירה, לערבב 50 מ"ל DMEM (w / o pyruvate / גלוטמין, Invitrogen 11,960), 50 מ"ל Neurobasal בינוני (Invitrogen 211,034), 375 GlutaMax μl (100 x, Invitrogen 35,050), 5.5 מ"ג נתרן pyruvate (סיגמה P2256), 2 מ"ל B27 (Invitrogen 17,504), 6.3 מ"ג N-acetylcysteine ​​(Sigma A8199), 1 מ"ל של סאטו המניה (המניה x 100, ראה להלן), 25 μl של d-ביוטין מניות (4000 x המניות, 40 מיקרומטר PBS מאוחסנים aliquots ב -20 ° C. Sigma B4639), 100 μl של אינסולין (1000 x המניות, 5 מ"ג / מ"ל ​​HCl 0.01N מאוחסנים aliquots ב -20 ° C, Sigma 16,634), ו - 1 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין (100 x המניות, Invitrogen 15,140), מסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C.

סאטו 100 x פתרון המניות: כדי להפוך 40 מ"ל של המניה: לערבב 40 מ"ל Neurobasal עם 400 מ"ג apo-transferrin (Sigma T2252), 400 מ"ג BSA (Sigma A9647), 10 μl של פרוגסטרון (25 מ"ג / מ"ל אתנול, המאוחסנים aliquots ב -20 ° C. סיגמה P8783), 64 מ"ג putrescine (סיגמה P7505), וכן 40 μl של נתרן סלניום (30 מיקרומטר PBS, מאוחסנים aliquots ב -20 ° C, Sigma S5261). סנן לעקר את הפתרון מניות סאטו, ולאחסן כמו aliquots ב -20 ° C.

Neuron בינוני ציפוי (PM): בינוני Neurobasal, 2% B27, 2mm גלוטמין (מניות 100x, aliquots המאוחסן ב -20 ° C, Invitrogen 25,030), 25μM חומצה גלוטמית (100 המניות, aliquots המאוחסן ב -20 ° C) 1% פניצילין / סטרפטומיצין.

Neuron בינוני בתרבות (CM): בינוני Neurobasal, 2% B27, 2mm גלוטמין (מניות 100x, aliquots המאוחסן ב -20 ° C) 1% פניצילין / סטרפטומיצין.

5-FdU מניות: מניות 100x, 1mm 5-fluoro-2'-deoxyuridine (Sigma F0503) and1mM uridine (Sigma U3003) במדיום Neurobasal. סנן מעוקרים מאוחסנים aliquots ב -20 ° C.

Papain פתרון העיכול (להפוך טרי לפני דיסקציה):

1. ממיסים 3.2 מ"ג L-ציסטאין (Sigma C-7352) ב 4ml DM
2. התאם ל-pH בסביבות 7.4 עם 1N NaOH (מבחן על מקלוני הבדיקה pH) ומקום באמבט מים ב 37 ° C
   הערה: בצע את הצעד הבא ממש לפני עיכול רקמות (ראה להלן).
3. הוסף papain לריכוז סופי של יחידה 20 / ml
4. סנן לעקר (0.22mm), ואת המקום באמבט מים ב 37 ° C

טריפסין פתרון מעכבי (לעשות טרי לפני דיסקציה):

1. להמיס 0.2 גרם מעכב טריפסין (Sigma T7295) ב DM 20ml
2. בדוק pH ולהתאים את ה-pH ל ~ 7.4 עם 1 N NaOH
3. סנן לעקר, ומקום באמבט מים ב 37 ° C

המוח Dissection

ההתקנה:

• מלקחיים מעוקרות ומספריים
• 70% אתנול
• ממחטת נייר diap נקיאה כרית על הספסל
• 10 ס"מ צלחות פטרי עם קרים כקרח DM עבור הרחם ואת העובר על הספסל
• קרח על פלטפורמת מיקרוסקופ לנתיחה
• 2-3 מנות 6cm עם DM על הקרח
• PM חמה אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים

1. להרדים הרה Sprague-Dawley חולדה (E16) על פי נוהל שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים קשר מוסדי שלך הוועדה (IACUC)
2. הנח את חולדה על כרית חיתול ואלכוהול לעקר על אזור הבטן
3. השתמש פינצטה כדי להחזיק את עור הבטן מספריים לעשות חתך בצורת V חיתוך רק את העור
4. מפושקות את העור ולהשתמש אחר פינצטה ומספריים מעוקרים לחתוך דרך שכבת השריר
5. חלץ את שרשרת של שקי העובר ולהעביר אותם לתוך צלחת 10 ס"מ המכיל קר כקרח DM
6. בעזרת מספריים microdissection, להסיר בזהירות כל העובר מן השק והמוח מעובר אחד, והמקום משוחררים המוח לתוך צלחת 10 ס"מ נקי עם DM על פלטפורמת קרח
7. במנדף למינרית תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר המוח התיכון / למוח האחורי מקטעים להשתמש במלקחיים בסדר להסיר קרומי המוח, הקורטקס ולהעביר ניקה / ההיפוקמפוס לצלחת 6cm חדש עם DM על חבילת קרח
   הערה: בשלב זה, הרקמה מוכן לעיכול האנזים.
8. הפוך את papain פתרון מעכב טריפסין ולסנן לעקר
9. הסרת עודפי DM של קליפת המוח / hippocampi
10. הוסף 4ml של הפתרון papain מוכן לעיכול
11. העברת כל תוכן הצינור 50 מ"ל ובמקום הצינור פלקון באמבט מים ב 37 ° C 5 דקות בדיוק
12. הסר פתרון papain עם פיפטה
13. הוסף 5 מ"ל מעכב טריפסין פתרון, מערבולת הצינור, ומקום באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות
14. הסר מעכבי טריפסין פתרון
15. חזור על שלב 13 ו 14 שלוש פעמים
16. הוסף PM חמים 20ml
17. Triturate עד גושים כל נעלמו (~ 20-30 פעמים)
18. צנטריפוגה ב 100xg עבור 7min
19. Resuspend את הכדור ב 10 מ"ל PM ולשטוף פעמיים על ידי צנטריפוגה
20. Resuspend את הכדור ב 10 מ"ל PM עבור תרבויות נוירון רגיל או NBB27/DMEM עבור תרבויות המצרפי
21. לעבור את התאים באמצעות הנפות תא 70μm
22. ספירת תאים חיים
23. המשך תרבויות במצטבר כמפורט להלן או צלחת התאים על תרבויות נוירון קבוע
    הערה: בשלב זה, מועשר תרבויות נוירון יכולה להיות מושגת על ידי ציפוי התאים ניתק על PDL ציפוי צלחות בצפיפות של התא 200-640 / ² מ"מ בהתאם לצורך ניסויים. אחרי התאים המצורפת (~ 2-4H), להחליף בינוני עם ראש חמים. אם culturing במשך פרקי זמן ארוכים, ביום 4, להחליף מחצית בינונית עם CM חם. עבור מטוהרים מאוד תרבויות העצבית, מעכב mitotic 5-FdU (הריכוז הסופי 10 מיקרומטר) ניתן להוסיף את DIV2 לעכב שאינם התפשטות תאים עצביים (כלומר, במהלך DIV2-3). לאחר התאוששות CM עבור 2 ימים, תאים שטופלו שוב דופק עוד 2 ימים (DIV 6-7) ואחריו שינוי בינוני מלא עם 5-FdU. לאחר מכן, להחליף מחצית בינונית עם, CM טרי חם מדי 3-4 ימים. נוירונים הם קיימא עבור עד 4 שבועות.

מצרפי הכנת ציפוי

1. להשעות תאים ניתק במדיום NBB27/DMEM המכיל 1x סאטו, 10ng/ml CNTF ו 10μM forskolin בצפיפות של 2x10 ⁶ תאים / מ"ל
2. העברת 2ml ההשעיה תא לבאר כל צלחת 6-גם ללא ציפוי
3. תרבות עבור 3 לילות. כל יום, בעדינות resuspend התאים פעם באמצעות Pipetman P1000
   הערה: תאים להתחיל ליצור אגרגטים (איור 1).
4. ביום שלפני ציפוי צבירה, מעיל צלחת / coverslips עם Matrigel:
   • מדולל מניות Matrigel (גורם גדילה מופחת, BD Biosciences 354230) 01:20 מקור DMEM על הקרח
     הערה: aliquots Matrigel צריכים להיות מוכנים לכל פרוטוקול היצרן. כל הטיפים, צינורות Eppendorf פתרונות להכנת aliquots של המניה אמור להיות קר, כדי למנוע פילמור Matrigel. Aliquots של Matrigel נשמרים ב -80 ° C ו מופשר ב 4 ° C.
   • מעיל בעבר PDL מצופה coverslips עם 300μl/well הפתרון Matrigel בדילול לילה 37 ° C חממה
   • לשטוף עם PBS חמים, ואז לשטוף צלחת עם חם סטרילי DDH ₂ O ולהשאיר את הצלחות בחממה.
5. 3 ימים לאחר היווצרות צבירה, בעדינות resuspend תאים שוב מסננת את ההשעיה דרך רשת 200μm לתוך צינור פלקון 50 מ"ל. אפשר אגרגטים ליישב לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה (~ 3-5min)
6. מוציאים בזהירות supernatant
7. הוסף בינוני, בעדינות resuspend המצרפים ולתת להם להתיישב שוב. חזור על תהליך זה מספר פעמים על מנת להסיר תאים מתים, תאים בודדים ופסולת. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק אם supernatant עדיין מכילים שאינם מצטברים התאים debris
8. בעדינות resuspend המצרפים במדיום NBB27/DMEM אותו (איור 1) ולספור אגרגטים
9. התאם את צפיפות של אגרגטים כדי aggreggats/50ul סביב 25-30
10. העברת aliquots (500 1000μl) של ההשעיה במצטבר לצינורות 2ml Eppendorf עבור ציפוי
    הערה: מאחר המצרפים נוטים להתיישב אל החלק התחתון של הצינורות, חשוב להפוך את צינורות מרובים של ההשעיה במצטבר עבור ציפוי. בעדינות resuspend המצרפים לעתים קרובות לפני זריעה אותם על coverslips מצופה או צלחות תרבות על מנת להבטיח מספר דומה של אגרגטים מצופה על כל coverslip.
11. קחו את הצלחת תרבות המכילה Matrigel מצופה coverslips מן החממה. הסר פתרון מבאר כל, לשטוף את coverslips עם PBS חם DDH ₂ O, ולאחר מכן לזמן קצר ויבש. עכשיו הם מוכנים זריעת המצרפי
12. היפוך צינור המכיל ההשעיה במצטבר כדי לאפשר להם להיות מופץ באופן שווה לפני זריעה. טען 50μl ההשעיה במצטבר למרכז coverslip כל, בעדינות לשים את הצלחת בחזרה חממה ללא הפרעה נוספת כדי לאפשר אגרגטים לצרף באופן שווה על coverslip
    הערה: צפיפות של אגרגטים הוא קריטי. אם מצרפים הם זורעים קרוב מדי זה לזה, או אם צפיפות זריעה היא גבוהה, הם נוטים להתמזג יחד ככל שהם גדלים.
13. הוסף DMEM/NBB27medium נוספים (500 μl) ל 4-6 שעות כל טוב מאוחר או מוקדם בבוקר
14. כדי לשמר את התרבות המצרפי, חצי שנה את בינונית כל 3-4 ימים. כאשר השינוי בינוני, להיזהר שלא לשבש את אגרגטים זה נעשה על ידי הוספת בעדינות בינוני לאורך הקיר בצד של הבאר.
    הערה: שעות ספורות לאחר אגרגטים המצורפת צלחת, תולדה של אגרגטים neurite ניתן לצפות. האקסונים לגדול במהירות בשבועיים הראשונים וליצור קשרים בין שפע אגרגטים (איור 2). אבות גליה להעביר רדיאלית מתוך אגרגטים להבדיל לאורך זמן לתוך האסטרוציטים ו oligodendrocytes בוגרת.

באיור 1. בניגוד שלב תמונות של תאים ויוצרים אגרגטים בכל יום אגרגטים שונים לאחר כביסה.

איור 2. בניגוד שלב תמונות של תרבות המצרפי 2 ו - 12 ימים לאחר seeded על Matrigel מצופה coverslips.

Discussion

מחקרים מוקדמים דיווחו על היווצרות של הסינפסות המיאלין בוגרת ברוטציה בתיווך תרבויות חינם המצרפי צף ^1. CNS תרבות המצרפי המערכת המתוארת כאן משלבת סרום ללא צמיחה של ובתאים multipotent בשלושה אגרגטים ממדי עם הנוחות של תרבויות מסורתיות 2D כדי להקל על ניתוח של התפתחות הנדידה, תא והבחנה במבחנה. מערכת יכולות להיות משונות המשמש מבשר עצביים תא מחקר עבור חקירת נוירון, גליה אינטראקציות. לדוגמה, תאים מהונדסים גנטית, כמו אבות oligodendrocyte ² יכולים להתווסף התרבויות המצרפי. אפקט של תאים חיסוניים כגון microglia ומקרופגים או חומרים כימיים שונים על התפתחות והתמיינות של נוירונים גליה ניתן ללמוד גם. Reaggregates של מטוהרים לתאי הגנגליון ברשתית לאחרונה בשימוש ללמוד myelination CNS ב cocultures עם oligodendrocytes בהעדר תאים אחרים ^3. בהסכם עם הדו"ח הקודם ^4, Matrigel נראה מעולה PDL בכך שהוא מקדם את הידבקות התא מאיצה תולדה neurite והבחנה גליה. Matrigel משמש אפוא תשתית עבור אגרגטים התא בפרוטוקול זה.