Produção lentivírus

Summary

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Abstract

Interferência de RNA (RNAi) é um sistema de silenciamento de genes em células vivas. Em RNAi, genes homólogos em seqüência de curto RNAs de interferência (siRNA) são silenciadas no estado pós-transcricional. RNAs hairpin curto, precursores de siRNA, podem ser expressas utilizando lentivírus, permitindo a RNAi em uma variedade de tipos de células. Lentivírus, como o Vírus da Imunodeficiência Humana, são capazes de infectar tanto divisão e não divisão das células. Vamos descrever um procedimento que a lentivírus pacote. Embalagem refere-se à preparação de vírus competentes de vetores de DNA. Sistemas de produção Lentivirus vector são baseados em um 'split' do sistema, onde o genoma viral naturais foi dividida em construções auxiliares individuais plasmídeo. Essa divisão dos diferentes elementos viral em quatro vetores separados diminui o risco de criar um vírus de replicação com capacidade de recombinação do genoma acidental lentiviral. Aqui, um vetor contendo os shRNA de interesse e de três vetores de embalagem (p-VSVG, PRSV, pMDL) são transitoriamente transfectadas em células humanas 293. Depois de pelo menos um período de incubação de 48 horas, o sobrenadante contendo o vírus é colhido e concentrada. Finalmente, título de vírus é determinado pelo repórter (fluorescente) expressão com um citômetro de fluxo.

Protocol

Parte 1: Transfecção de HEK 293 células para produzir Lentivirus

* 24 horas antes de transfecção, placa de 2,5 X 10 ⁶ células em um prato de 10 centímetros de uma confluência de 50-70% no dia seguinte.

1. Iniciar este protocolo, preparando o DNA com o qual se vai depois de uma transfecção as células para fazer vírus. Primeiro, diluir FuGENE 6 Transfection reagente Roche, um reagente de lipídios que fazem as células ocupam DNA. Em um tubo de 1,5 ml, pipetar 30μl FuGENE 6 em meio isento de soro 600ul (SFDMEM). Tenha cuidado para não deixar FuGENE toque no lado do tubo quando é entregue ao meio. Deixe esta FuGENE e SFDMEM misturar e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
2. Na tampa do tubo, misturar 4 mg lentiviral plasmídeo com 4 mg a cada 3 ^ª geração de vetores virais embalagem (pMDL, PRSV e pVSV-G). O plasmídeo lentiviral contém o DNA do vírus irá inserir no genoma de cada célula que infecta, enquanto os vetores de embalagens contêm genes para todas as outras proteínas necessárias para fazer um lentivírus.
3. Feche a tampa e misturar invertendo o tubo várias vezes.
4. Incubar 15-20 minutos em temperatura ambiente.
5. Pipeta conteúdo inteiro do tubo em 293 placa. Misture delicadamente a placa de inclinação para trás e para frente.
6. As células voltem para a incubadora e permitir que a produção viral continuar por 48-96 horas antes da colheita.
7. Durante a incubação, a 293 células transcrever o DNA de interesse do plasmídeo lentiviral, criando uma cópia de RNA da construção lentiviral. Eles também transcrever e traduzir os genes nos vetores de embalagens em proteínas virais. Estas proteínas continuar a fazer vírus contendo a versão do seu RNA construir lentiviral, que o vírus irá reverter transcrever e inserir no genoma de todas as células que infecta.

Parte 2: Harvest Lentivirus

1. Após período de incubação, retirar células fora da incubadora e use uma seringa descartável de 10ml, para remover o sobrenadante, que agora contém o vírus. Haverá cerca de 10ml do sobrenadante.
2. Coloque um filtro de seringa de 0,45 para a ponta e filtrar o vírus em um tubo de ultracentrífuga Beckman. O filtro permite que apenas os vírus, e não as células a passar.
3. Antes de deitar fora, incubar todas as células produtoras de vírus, placas de cultura, seringas e filtros em água sanitária 10% por 45 minutos.

Parte 3: Concentração Lentivirus via Ultracentrifugação

1. De carga em tubos de centrífuga SW-41Ti ou SW-28 baldes de rotor.
2. Use soro livre de DMEM para equilibrar todos os vírus contendo tubos para dentro de 0.2g.
3. Seal fecha baldes rotor e conectá-los em rotor antes de colocar dentro do rotor ultracentrífuga
4. Girar o vírus por 90 minutos em uma ultracentrífuga a 4 ° C a 25.000 rpm em um rotor SW-41Ti ou 24.000 rpm em um rotor SW-28.
5. Em uma capa de cultura de tecidos, inverter os tubos de cabeça para baixo para derramar sobrenadante em um recipiente contendo água sanitária a 10%.
6. Use uma Kimwipe para absorver o excesso de líquido ao redor do pellet e inverter o tubo em um rack conveniente para não mais que cinco minutos.
7. Para voltar a suspender o pellet viral, use uma ponta de filtro para adicionar 100 mL de PBS estéril ao tubo, então pipeta cima e para baixo cerca de 20 vezes.
8. Deixe o vírus a 4 ° C durante a noite para completar re-suspensão. Pode-se armazenar preps viral a 4 graus por cerca de uma semana e à temperatura de -80 graus por até um ano. Lembre-se de tratar todos os tubos vazios com água sanitária a 10% antes de descartar.
9. Se alguém pretende usar a preparação viral por mais tempo do que a semana 1, fazer alíquotas mínima de 5-20μl para futuros experimentos e uma alíquota de 3 a 5μl para a titulação. Congelar e armazenar as alíquotas de 80 de menos.

Parte 4: Titulação Lentivirus por citometria de fluxo

1. O próximo passo é determinar o título viral por citometria de fluxo. Este método só funciona nos casos em que o plasmídeo lentiviral contém um gene repórter fluorescente. A idéia é que quando o vírus infecta uma célula, ele introduz o DNA lentiviral plasmídeo no genoma dessa célula. Da célula infectada, então, transcrever e traduzir os genes que você incluiu no plasmídeo lentiviral, e se você incluiu um gene repórter fluorescente, as células infectadas ficam fluorescentes. O nível de fluorescência representa a potência, ou título, do vírus.
2. Para cada ação viral para ser tituladas, diluir 3 mL do vírus concentrado em 1,5 ml de meio completo (DMEM, pen-strep, glutamina, FBS).
3. Em poços de 1-6 em uma única linha de uma placa de 96 poços, execute as seguintes diluições em série: a todos os seis poços adicionar 100 ml de DMEM completo de mídia. Para o primeiro poço adicionar 100μl dos meios de comunicação, sem vírus (este é o seu controle sem mácula), para o segundo poço adicionar 100 ml do vírus diluído (que é para 1 ml equivalente do vírus diluído), para o terceiro também adicionar 100 ulda mistura a partir do segundo poço, para o quarto poço adicionar 100 ml do terceiro poço, para o quinto também adicionar 100μl do poço 4, e para o sexto bem adicionar 100 ul da quinta também. Finalmente assumir 100ul do poço 6 e descartar em lixívia. A diluição em série foi realizada em cada poço tem metade do volume de vírus em comparação com o anterior.
4. Trazer o volume total em todos os poços de 200μl. Note que estes são diluições apenas sugerido, que deve funcionar bem para titulação vírus mais concentrado. Se o vírus é baixa no título, ou não concentrada pode-se necessário ajustar as diluições.
5. Tratar qualquer vírus não utilizado diluído em água sanitária 10% por 45 minutos antes de descartar em um recipiente de resíduos de risco biológico.
6. Adicionar ~ 15000 saudável, dividindo ativamente 293 células para cada um dos 6 poços. A única placa de 96 poços pode ser usado para título 16 preps viral.
7. Retorno células a 37 graus incubadora com 5% de CO ₂ e permitir a infecção para prosseguir durante pelo menos 48 horas.
8. Após a incubação, as células são analisadas para expressão repórter (no nosso caso de fluorescência), com um citômetro de fluxo. Partículas virais são quantificada pela porcentagem de células fluorescentes por poço.

Calcule o número de unidades infecciosas por ml com a seguinte fórmula:

_{(# De células por poço no dia de células infecção repórter X positivo) X 1000}
^{______________________________________________________
ml do vetor adicionado ao bem}

Parte 5: Resultados Representante:

Depois de 48 horas de transfecção pós período de incubação, a placa de 293 células deve ser em torno de 90% fluorescentes. A elevada percentagem de células fluorescentes é uma indicação de uma alta porcentagem de células produtoras de vírus.

Após a centrifugação, o pellet viral é pouco visível quando ressuspensão. Isso é normal como o pellet é clara e muito pequenas.

Ao interpretar os resultados citômetro de fluxo nota, que só se pode alcançar cálculos título precisos quando infectados (fluorescente), as células não receberam mais do que uma integração viral por célula. , A fim de garantir que este for o caso, use com células <taxa de infecção de 15% para os cálculos. Células com maiores taxas de infecção provável recebeu vários integrantes viral por célula. As diluições sugerido no passo 2 deve render várias amostras dentro desta faixa de infecção. Idealmente, use várias amostras para gerar um gráfico de titulação (linha linear) a partir do qual você pode calcular o título final, mas você pode calcular título usando uma única amostra, se necessário. Pode-se esperar título de 1,0 x 10 ⁷ TU / ml para un concentrado de vírus e 1,0 x 10 ⁸ TU ml / para o vírus concentrado.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.