Производство лентивирус

Summary

Для того, чтобы лентивирусов, ДНК векторы трансфекции в человеческий 293 клеток. После сбора урожая и обогатительное супернатант, титра вируса определяется флуоресценции выражение потока цитометр.

Abstract

РНК-интерференция (RNAi) представляет собой систему генов в живых клетках. В RNAi, гены гомологичные последовательности на короткий вмешательства РНК (миРНК) заставляют молчать в посттранскрипционных государства. Короткие РНК шпилька, предшественники миРНК, могут быть выражены с помощью лентивирус, что позволяет RNAi в различные типы клеток. Лентивирусов, такие как вирус иммунодефицита человека, способны заражать обе деления и не делящихся клеток. Опишем процедуру, которая для упаковки лентивирусов. Упаковка относится к подготовке компетентных вирус из ДНК векторы. Лентивирусов производственных систем вектора основаны на "разбить" система, где естественный вирусный геном был разделен на отдельные вспомогательные плазмиды конструкций. Это расщепление различных вирусных элементов на четыре отдельных векторов уменьшает риск создания репликации вируса, способного придаточных рекомбинации лентивирусов генома. Здесь вектор, содержащий shRNA интересов и три вектора упаковки (р-VSVG, pRSV, pMDL) являются временно трансфекции в человеческий 293 клеток. После по меньшей мере 48-часовой инкубации вируса содержащих супернатант собирают и концентрируют. Наконец, титра вируса определяется репортера (флуоресцентные) выражение потока цитометр.

Protocol

Часть 1: Трансфекция HEK 293 клеток продуцировать лентивирусов

* 24 часов до трансфекции, пластины 2,5 • 10 ⁶ клеток в 10 см блюдо для слияния 50-70% на следующий день.

1. Начало этому протоколу, подготовив ДНК, с которой позже один трансфекции клетки, чтобы сделать вирус. Во-первых, разбавленный FuGENE 6 Трансфекция реагента Roche, липидный реагентов, которые делают клетки занимают ДНК. В 1,5 мл трубки, пипетки 30μl FuGENE 6 в 600ul бессывороточной среде (SFDMEM). Будьте осторожны, чтобы не позволить FuGENE сенсорным стороне трубки, как он будет доставлен в среду. Пусть это FuGENE и SFDMEM перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
2. В крышку трубки, смешать 4 мкг лентивирусов плазмиду с 4 мкг каждого ^3-го поколения вирусных векторов упаковки (pMDL, pRSV и pVSV-G). Лентивирусов плазмида содержит ДНК вируса будет вставить в геном каждой клетки она заражает, в то время как упаковка векторы содержат гены для всех других белков, необходимых, чтобы сделать лентивирусов.
3. Закройте крышку и перемешать путем обращения трубку несколько раз.
4. Инкубируйте 15-20 минут при комнатной температуре.
5. Внесите все содержимое тубы в 293 пластины. Осторожно перемешать, наклоняя пластину назад и вперед.
6. Вернуться клетки инкубатора и позволяют вирусная производства продолжаться в течение 48-96 часов до сбора урожая.
7. Во время инкубации клеток 293 расшифровать ДНК представляют интерес с лентивирусов плазмиды, создавая копию РНК лентивирусов конструкции. Они также расшифровать и перевести генов в упаковке векторов в вирусные белки. Эти белки действовать, чтобы вирусы содержащие РНК версию вашего лентивирусов конструкция, которая вирус будет обратный транскрибировать и вставьте в геномы всех клеток, он заражает.

Часть 2: Harvest лентивирусов

1. После инкубационного периода, взять клетки из инкубатора и использовать одноразовые, 10 мл шприца, чтобы удалить супернатант, который теперь содержит вирус. Там будет около 10 мл надосадочной жидкости.
2. Прикрепить 0.45μM фильтра шприц наконечник и фильтр вируса в трубке ультрацентрифуге Beckman. Фильтр позволяет только вирусы, а не клетки, чтобы пройти.
3. До списания, инкубировать все вирус-продуцирующие клетки, культуры пластин, шприцы и фильтры в 10% гипохлоритом натрия в течение 45 минут.

Часть 3: лентивирусов Концентрация через ультрацентрифугирования

1. Нагрузка пробирок в SW-41Ti или SW-28 ротор ведра.
2. Используйте бессывороточной DMEM, чтобы сбалансировать все вируссодержащих труб с точностью до 0,2 г.
3. Печать закрыть ротора ведра и подключить их на ротор перед размещением ротора внутри ультрацентрифуге
4. Спиновые вируса в течение 90 минут в ультрацентрифуге при 4 ° С при 25 000 оборотов в минуту в SW-41Ti ротора или 24000 оборотов в минуту в SW-28 ротор.
5. В капотом культуры ткани, инвертировать трубы вверх дном, чтобы вылить надосадочную в контейнер, содержащий 10% гипохлоритом натрия.
6. Используйте Kimwipe поглощать избыточную жидкость вокруг гранул и инвертировать трубка в удобной стойке не более чем на пять минут.
7. Чтобы снова приостановить вирусных гранул, используйте фильтр наконечника добавить 100 мкл стерильной PBS к трубе, то пипетку вверх и вниз примерно в 20 раз.
8. Оставьте вирус при температуре 4 ° С в течение ночи, чтобы полностью изменить подвеску. Можно хранить вирусных подготавливает на 4 градуса в течение 1 недели, а при температуре -80 градусов на срок до одного года. Не забывайте лечить все пустые трубы с 10% отбеливателя, прежде чем выбросить.
9. Если один намерен использовать вирусный приготовительный более чем на 1 неделю, сделать минимальный аликвоты 5-20 мкл для будущих экспериментов и 1 аликвоту от 3 до 5 мкл для титрования. Замораживание и хранение аликвот при температуре минус 80.

Часть 4: лентивирусов титрования с использованием проточной цитометрии

1. Следующим шагом является определение вирусного титра с помощью проточной цитометрии. Этот метод работает только в тех случаях, когда лентивирусов плазмида содержит ген флуоресцентного репортер. Идея заключается в том, когда вирус заражает клетку, он вводит лентивирусов плазмидной ДНК в геном, что клетки. Инфицированной клетки затем расшифровать и перевести генов, включенных в лентивирусов плазмиды, и если вы в том числе флуоресцентный ген репортер, инфицированные клетки и будут светиться. Уровень флуоресценции представляет потенцию, или титр вируса.
2. Для каждой вирусной акции должны быть оттитрованы, развести 3 мкл концентрированного вируса в 1,5 мл полной среды (DMEM, ручка-стрептококк, глутамин, ФБС).
3. В скважинах 1-6 в один ряд 96 ячейках, выполните следующие серийные разведения: всем 6 скважин добавить 100 мкл полной DMEM СМИ. Для первой скважины добавьте 100 мкл СМИ без каких-либо вирусом (это ваш безупречный контроль), на второй и добавить 100 мкл разбавленного вируса (что эквивалентно ТО1 мл неразбавленного вируса), к третьей и добавить 100 мклсмеси из второй скважины, на четвертый и добавьте 100 мл с 3-го и, в пятый и добавьте 100 мкл с 4-го хорошо, и к шестому также добавить 100 мкл с 5-го хорошо. Наконец принять 100 мкл из шестого хорошо и выбросить в отбеливатель. Серийного разведения была выполнена хорошо, где каждый имеет половину объема вируса по сравнению с предыдущей.
4. Довести общий объем во всех скважинах в 200 мкл. Обратите внимание, что это всего лишь предложил разведения, которые должны хорошо работать для titering наиболее концентрированном вирусов. Если вирус низким титром или неконцентрированных один, возможно, потребуется скорректировать разведений.
5. Лечить неиспользованные разбавленный вирус с 10% гипохлоритом натрия в течение 45 минут, прежде чем выбросить в контейнер для биологически опасных отходов.
6. Добавить ~ 15000 здоровых, активно делящихся клеток 293, на каждый из 6 скважин. С 96-ю лунками может быть использован для титр 16 вирусных подготавливает.
7. Вернуться клетках до 37 градусов инкубаторе с 5% CO ₂ и позволяют инфекции проводили в течение по крайней мере 48 часов.
8. После инкубации клетки анализируют на репортера выражении (в нашем случае флуоресценции) с потоком цитометр. Вирусные частицы измеряют процент флуоресцентных клеток на лунку.

Рассчитайте число инфекционных единиц на мл по следующей формуле:

_{(Кол-во клеток на лунку в день инфекции X репортер положительных клеток) X 1000}
^{______________________________________________________
мл вектора добавляются также}

Часть 5: Представитель Результаты:

После 48-часовой инкубации трансфекции сообщение периода, пластина из 293 камеры должны быть на уровне около 90% флуоресцентные. Высокий процент флуоресцентные клетки является показателем высокого процента вирусом клеток.

После центрифугирования вирусных гранул едва виден, когда ресуспендирования. Это нормально, поскольку гранулы ясна и очень мало.

При интерпретации результатов потока цитометр, обратите внимание, что можно достичь только точного расчета титра при заражении (флуоресцентные) клетки получили не более одного вирусного интеграции на ячейку. Для того чтобы обеспечить, что дело обстоит именно так, использовать ячейки с <15% уровень заражения для расчетов. Клетки с более высокой частотой инфекции вероятно, получили множественные вирусные integrants на ячейку. Разведений предложено в шаге 2 должно дать несколько образцов в пределах этого диапазона инфекции. В идеале, используйте несколько образцов для создания титрования участка (линейная линия), из которого можно вычислить окончательные титры, но вы можете рассчитать титр с помощью одного образца, если это необходимо. Можно ожидать, титр 1,0 х 10 ⁷ ТУ / мл в течение не-концентрированного вируса и 1,0 х 10 ⁸ TU / мл концентрированного вируса.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.