Summary
发展循环通过红细胞裂解，以确保高质量的样品无细胞损失隔离外周血有核细胞富集自动化微流体装置。
Abstract
一个自动化微流体血液裂解装置的协议，在本报告中详细介绍。循环有核细胞（CNCS），包括白细胞和内皮细胞，提供一个理想的平台，为个人的免疫状态的更新状态。微流体协议允许无选择性的细胞损失和样品制备变性，由于用户介导的步骤浓缩的CNC。简单地说，协议包括设备制造，样品的采集，设备安装，并通过微腔血。整个器件内的血液迅速去离子水混合，在约10秒50微米× 150微米的微流体通道。在这个时间跨度红细胞裂解由于低渗条件。通道底部的人字形结构，确保充分混合细胞暴露为一个恒定的环境。剩余的单元格返回等渗条件下，在设备的出口，用2％多聚甲醛固定，离心分离CNC的红细胞碎片，并在流缓冲暂停染色和流式细胞仪分析。结果表明清洁流式细胞仪散点图数控保存种群。这种设备和协议的意义数控人口分析疾病的发病机制的研究和理解。因此，自动化，实效性，简单的微流控协议证明。
Protocol
第1部分。微流控设备制造
创建一个微流体裂解装置的硅母模使用标准光刻技术与设备，在路易斯维尔洁净室大学[1]。 AutoCAD的（欧特克公司，圣拉菲尔，CA）是用来生成一个透明的面具（Fineline成像，科罗拉多州的斯普林斯，CO），创建渠道的负面副本。从硅掌握使用弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS;道康宁，美联，MI）的软光刻技术的模具制造微流体裂解装置。弹性体与复制的渠道被释放，并用20号针头（小零件，美丽华，佛罗里达州。）信道接入孔打孔。 PDMS的晶圆是不可逆转的保税通过氧等离子体载玻片和实验测试。
第2部分。运行裂解装置的议定书“
微流体装置已经制造和测试后，红细胞裂解试验准备开始。以下部分详细说明协议的微流体装置。
2.1样品采集
- 4毫升的血液样本收集从肘正中静脉，肝素作为抗凝血剂2毫升绿色顶级vaccutainers前对病人的前臂静脉。
- 放弃第2毫升的管，因为它包含脱落的成熟内皮细胞（误报）。
- 重悬第二管，肝素与血液混合，向上和向下转动;立即保存在冰上。
- 1毫升血液转移到1.5 mL Eppendorf管。立即进程的血液样本（收集一小时内）。
2.2微流体装置，用PBS总理
- 获取粘接到玻璃微流体装置。按合适的访问油管（小零件，美丽华，佛罗里达州），在入口和出口（图1）的直径略大。
- 30号注射器针头（小零件，美丽华，佛罗里达州）连接到每个管的进气口，提供宏观到微观的接口。
- 填写与1X PBS 1 ml注射器，并确保获得摆脱气泡弹注射器针头。 PBS装1 ml注射器连接入口1的微流体装置。推注射器含有1X PBS轻轻用手，直到溶液流进2，然后立即钳与一个标准的Office活页夹夹入口2
- 继续推动1X PBS液，直到达到微流体设备的出油口。一旦解决方案流出出水口，出口管钳与另一粘结剂剪辑。
- 继续推进1 ml注射器，直到1X PBS流进3，和与其他Office活页夹夹钳入口3端口。微流体装置现在已经完全做好准备。
图1显示各自的解决方案和插座入口装置的示意图。
2.3制备注射泵和解决方案
- 要校准泵，遵循以下步骤：
- 对于大哈佛注射泵（哈佛大学，PHD 22/2000部分＃702000）：22.5毫米，流速600μL/ min的设置直径配置。
- 对于小哈佛注射泵（哈佛，碧加上部分＃702213）：设置直径配置4.61毫米，流速20μL/分钟。
- 填写一个30毫升注射器，用无菌去离子水。这可以通过直接退出的解决方案，从50 ml锥形管。 （标签注射器）
- 2X磷酸盐缓冲液（PBS），2％多聚甲醛（PFA）在第9步中所述的程序，填写第二个30 ml注射器。 （标签注射器）
- 填写与1X PBS 1 ml注射器从15 ml锥形管中的分装，使用在第9步中所述的程序。
- 将30 ml去离子水入口2注射器和2X PBS 30毫升注射器入口3（确保你唐吨陷阱气泡在管或微流体装置）。拆下进气口2和3和出口管钳。 1X PBS 1 ml注射器连接到进气口1。避免引入气泡填充液体的注射器针头，注射器连接，并轻弹注射器针头摆脱泡沫。
2.4红细胞裂解
- 注射器上设置适当的哈佛泵概述如下：
- 大哈佛注射泵设置的两个30毫升注射器（一个含无菌，去离子水和其他与2X PBS，2％的煤灰）。
- 设置1毫升（含1 × PBS）上的小哈佛注射泵的注射器。
- 在废物收集商将出口管（50 ml锥形管，标记瓦特阿斯泰）。
- 打开大哈佛注射泵（用30毫升注射器），并让它运行一分钟。 （确保没有气泡和没有在设备或管路中泄漏）。
- 打开小哈佛注射泵上，并让它运行额外的分钟。 （确保没有气泡和没有在设备或管路中泄漏）。停止泵。微流体设备现在已经可以使用。
- 删除小哈佛注射泵包含1X PBS 1 ml注射器。
- 取得血液样本后，填写用0.05毫升无菌1X PBS 1 ml注射器，没有捕获任何气泡。接下来，填充注射器0.5毫升的血液从Eppendorf管中获得。 （1 ml注射器将包含一个最终成交量为0.55毫升的血液和1X PBS缓冲液。） 注 ：保持注射器垂直却使避免0.05毫升PBS的血液混合。
- 连接入口1含有血液的注射器和仔细装入注射器上的小哈佛注射泵（注射器装到泵垂直）（避免推到设备的血液通过管子）。
- 从废液管出口管取出，放在它的位置在一个干净的50 mL离心管中，并设置它的冰桶。
- 第一大哈佛注射泵开关，并让它运行1分钟。开始收集样品从插座到50 mL离心管。
- 开关上的小哈佛注射泵。
- 一旦在1毫升注射器的血液样本已完全通过设备前往，停止这两个泵。这大约需要20分钟。
- 离心5分钟收集到的样品在室温制动关闭在350 XG。
- 去除上清液放置在对面的白色颗粒枪头。删除尽可能多的可能，尤其是红色的细胞碎片上清，不扰民的白色颗粒。
- 向上和向下吹打重悬在1毫升流缓冲区（1X PBS，1％BSA牛血清白蛋白]，2％PFA）的样品。转移到1.5 mL Eppendorf管的样品。
- 离心5分钟在室温下在4 XG所收集的样本。使用相同的精度，前去除上清。
- 重悬在1毫升流缓冲震荡的样品。
2.5流式细胞仪分析的准备工作
- 使用流式细胞仪分析样品，加100μL的样品，以流式细胞仪检测管。
- 添加指定的抗体（确保正确的浓度）的样品100μL。
- 允许样品孵育40 C. 30分钟
- 洗两次流的缓冲区之前，流式细胞仪。清洗步骤包括添加250流缓冲液，振荡，离心5分钟，在350 XG，并移除上清液流式细胞仪检测管流体转。
- 250流缓冲液重悬沉淀。样品是准备通过流式细胞仪分析。
代表性的成果
通过微裂解装置和后处理协议的全血已运行，消除红细胞和有核细胞（CNCS）丰富循环。理想的结果将产生一个单独的数控人口的清洁流式细胞仪散点图。在下面的图2和3显示的是全血样本的散点图比较无红细胞裂解红细胞裂解与微流控协议前向散射（FSC）与侧散射（SSC），光轴。由此可以看出，微流体富集协议是必要的，以获得一个干净的流式细胞仪散点图的。
图2流式细胞仪检测全血样品的分散没有与FSC和SSC轴红细胞裂解情节。
图3。核细胞循环与微流体溶解红细胞人口与FSC和SSC轴标记流式细胞仪散点图。 1区（红色）代表区域2（绿色）代表单核细胞，淋巴细胞，3区（蓝色）代表粒，4区（紫色）尚未特点。
协议中的吸管去除红细胞碎片也必要时重要。在下面的图4是散点图呈现出红细胞碎片的盈余。虽然不是混浊的散点图，如图2，必须考虑到由于红细胞碎片在数据分析中的添加事件。
图4。流式细胞仪散点图描绘红细胞碎片，被视为一个集群5区（青色）的事件。
为某些抗体表型标记染色细胞也会产生特征的结果。在下面的数字是3个不同的白细胞人口渍：抗体表型淋巴细胞，单核细胞，和粒细胞。图5描述了绘制与轴CD3和CD4淋巴细胞人口。单核细胞和粒细胞作为FSC对CD14和CD66b轴在图6-7所示，分别为。
图5。流式细胞仪散点图描绘淋巴细胞CD3和CD4轴。
图6描绘与FSC和CD14轴的单核细胞流式细胞仪散点图。
图7。流式细胞仪散点图描述与FSC和CD66b轴粒。
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Discussion
一个自动化微流体血液溶解协议的报道。值得一提的是在协议的关键步骤。在第P.2.1，重要的是要丢弃的血液小瓶样品中含有成熟的内皮细胞脱落，误报收集。另外，还要确保运行一小时内收集的血液样本。底漆第P.2.2微流体装置，它是重要的，初步摆脱了气泡。此外，应避免引入气泡时附加新的整个协议的针头注射器。 P.2.4节血1 ml注射器灌装时，一定要记住先添加1X PBS和血液，所有同时保持垂直的注射器，以避免混合两种解决方案。开始之前注射泵推动血液样本，确保大注射泵已经运行，因此该系统在全速。已完成样品后通过设备上运行，并已离心，小心地取出尽可能多的上清作为可能的，包括红细胞碎片，不扰民的白色颗粒。最后，在第P.2.5遵循制造商S协议，以保证正确的抗体浓度，添加100μL样品。
在临床研究中，微流控协议的应用是巨大的。个人的免疫状态，产生的CNC询问健康状况的重要信息，并可能有助于诊断和了解疾病的发病机制。比人类表达的肿瘤组织进行分析，通过血液样本收集这些访问数控人口更容易，更方便。流通中的一个要检查这些核细胞必须能够从其他血液成分，包括红细胞，报告的设备的主要功能丰富的人群。因此，这种研究从微血裂解协议将大大受益。
微流控协议的意义，出现在应用方面。由于核细胞富集在临床研究的血液需要，一个协议，只需要很少的专业知识和用户介导的步骤，产生清晰和一致的结果是重要的。微流控协议，确保通过自动化和控制曝光细胞对恶劣环境的一致性。随着在临床实验室数据的一致性将直接比较[2]。
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Acknowledgments
研究已经得到了华莱士阁下科尔特基金会早在转化研究事业奖。采血的帮助下添安德鲁斯，小儿血液/肿瘤，。也感谢萨姆豪森博士，流式细胞仪的核心，詹姆斯格雷厄姆布朗癌症中心，运行流式细胞仪检测样品的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | ||
| 30-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon tubing (.010" ID) | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000) | Harvard Apparatus | 702000 | |
| Syringe Pump (Harvard Pico Plus) | Harvard Apparatus | 702213 | |
| Flow cytometry tubes | DB Biosciences | 352052 | |
| Antibody stains | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | ||
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | ||
| 30 ml tube | Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
References
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
