Summary
Un dispositivo de microfluidos automatizado fue desarrollado para la circulación de enriquecimiento de células nucleadas de sangre periférica mediante lisis de los eritrocitos que garantiza el aislamiento de la muestra de alta calidad sin pérdida de células.
Abstract
En este informe, el protocolo de un sistema automatizado de dispositivo de microfluidos lisis de sangre se detalla. Distribución de células nucleadas (CNC), incluyendo los leucocitos y las células endoteliales, proporcionan una plataforma ideal para un estado actualizado sobre el estado inmunitario de un individuo. El protocolo permite a los microfluidos para el enriquecimiento de la CNC, sin pérdida selectiva de células y la variabilidad de preparación de muestras, debido a los pasos mediada por el usuario. En pocas palabras, el protocolo incluye la fabricación de dispositivos, recolección de muestras, la configuración del dispositivo y la ejecución de la sangre a través de la cámara de microfluidos. Dentro del dispositivo de sangre entera se mezcla rápidamente con agua desionizada durante aproximadamente 10 segundos en un canal de 50 micrones x 150 micrones de microfluidos. En este tiempo los eritrocitos se lisan lapso debido a las condiciones hipotónicas. Estructuras de espina de pescado en la parte inferior del canal que se mezcle bien y la exposición de las células a un medio ambiente constante. Las células restantes se devuelven a condiciones isotónicas a la salida del dispositivo, fijo con paraformaldehído al 2%, se centrifuga para separar los residuos de eritrocitos de CNC, y suspendido en buffer de flujo para la tinción y análisis por citometría de flujo. Los resultados muestran el flujo de los diagramas de dispersión limpia citometría con poblaciones CNC salvo. Importancia de este dispositivo y el protocolo se presenta en el estudio y la comprensión de la patogénesis de la enfermedad mediante el análisis de las poblaciones de CNC. Por lo tanto, la automatización, la eficacia y la simplicidad del protocolo de microfluidos son demostrados.
Protocol
Parte 1. Fabricación de dispositivos de microfluídica
Un molde maestro de silicio del dispositivo de microfluidos lisis fue creado usando técnicas de fotolitografía con el equipo en la Universidad de Louisville sala blanca [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) se utilizó para generar una máscara de transparencia (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) para crear réplicas negativas de los canales. El dispositivo de microfluidos lisis fue fabricado a partir del molde maestro de silicio mediante técnicas litográficas suave con el elastómero de poli (dimetilsiloxano) (PDMS, Dow Corning, Midland, MI). El elastómero con los canales replicados fue puesto en libertad, y los agujeros fueron perforados canal de acceso con una aguja de calibre 20 (piezas pequeñas, Miramar, FL.). La oblea PDMS fue unido irreversiblemente a un portaobjetos de vidrio mediante plasma de oxígeno y la prueba de la experimentación.
Parte 2. Protocolo para el funcionamiento de dispositivos de lisis
Después de que el dispositivo de microfluidos ha sido fabricado y probado, los experimentos con lisis de los eritrocitos está listo para comenzar. La siguiente sección detalla el protocolo para el dispositivo de microfluidos.
2.1 Recolección de muestras
- Recoger 4 mililitros de muestra de sangre de la vena cubital mediana, en la vena del antebrazo anterior del paciente con heparina como anticoagulante en dos 2 ml superior vaccutainers verde.
- Deseche los 2 primeros ml del tubo, ya que contiene desalojados células maduras endoteliales (falsos positivos).
- Volver a suspender el segundo tubo para mezclar con la sangre de la heparina girando hacia arriba y abajo, guardar inmediatamente en hielo.
- Transferir 1 ml de sangre a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Proceso de la muestra de sangre de inmediato (dentro de una hora de recogida).
2.2 El primer dispositivo de microfluidos con PBS
- Obtener un dispositivo de microfluidos unido al vidrio. Press-fit tubos de acceso (piezas pequeñas, Miramar, FL) de diámetro ligeramente mayor en las entradas y salida (Figura 1).
- Adjunte una aguja de la jeringa de calibre 30 (piezas pequeñas, Miramar, FL) a la tubería en cada una de las entradas de aire, proporcionando la macro a la interfaz de micro.
- Llene una jeringa de 1 ml con PBS 1X y asegúrese de deshacerse de las burbujas accionando la aguja de la jeringa. Conecte el PBS-cargado una jeringa a la entrada de uno en el dispositivo de microfluidos. Empuje la jeringa que contiene el PBS 1X suavemente con la mano hasta que la solución fluye de entrada 2, e inmediatamente después la abrazadera de entrada 2 con un clip de oficina carpeta estándar
- Seguir impulsando la PBS 1X hasta que el líquido llega al puerto de salida del dispositivo de microfluidos. Una vez que la solución sale de la toma de corriente, sujete el tubo de salida con otro clip de encuadernación.
- Seguir impulsando la jeringa de 1 ml hasta que el PBS 1X flujos de entrada 3, y la abrazadera de la entrada de 3 puertos con otro clip de Cuaderno de Office. El dispositivo de microfluidos está totalmente preparado.
Figura 1. Esquema del dispositivo muestra las entradas de las respectivas soluciones y toma de corriente.
2.3 Preparación de las bombas de jeringa y solución de
- Para calibrar las bombas siga estos pasos:
- Para la gran bomba de jeringa de Harvard (Harvard, PHD parte 22/2000 # 702000): Establece la configuración de diámetro de 22,5 mm, caudal 600 l / min.
- Para la pequeña bomba de jeringa Harvard (Harvard, Pico Además Parte # 702213): Establece la configuración de diámetro de 4,61 mm, caudal 20 l / min.
- Llene una jeringa de 30 ml con agua destilada estéril. Esto se puede lograr mediante la retirada de la solución directamente del tubo cónico de 50 ml. (Etiqueta de la jeringa)
- Llene una jeringa de 30 segundos con 2X tampón fosfato-salino (PBS), un 2% de paraformaldehído (PFA), utilizando el procedimiento descrito en el paso 9. (Etiqueta de la jeringa)
- Llene una jeringa de 1 ml con PBS 1X a partir de las alícuotas almacenadas en los 15 ml tubos cónicos, mediante el procedimiento descrito en el paso 9.
- Conecte la jeringa de 30 ml de agua desionizada a la entrada 2 y los 30 ml de PBS 2X jeringa a la entrada 3 (asegúrese de que usted no las burbujas de trampa t en el tubo o dispositivo de microfluidos). Retire la abrazadera de las entradas de 2 y 3 y el tubo de salida. Conecte el 1X PBS una jeringa en la entrada 1. Evitar la introducción de burbujas mediante la cumplimentación de la aguja de la jeringa con el líquido, la conexión de la jeringa, y agitando la aguja de la jeringa para eliminar las burbujas.
2.4 lisis de los eritrocitos
- Ajuste todas las jeringas en la correcta bombas de Harvard como se indica a continuación:
- Ponga los dos 30 ml jeringas (con alto contenido estéril, agua desionizada y la otra con 2X PBS, 2% PFA), junto a la bomba de jeringa grande de Harvard.
- Ponga la jeringa de 1 ml (con 1X PBS) en la bomba de jeringa pequeña de Harvard.
- Coloque el tubo de salida en un recipiente para residuos (50 ml tubo cónico que se denomina wAste).
- Encienda la bomba de jeringa grande de Harvard (con 30 jeringas ml) y se deja correr por un minuto. (Asegúrese de que no haya burbujas y no hay fugas en el dispositivo o en la tubería).
- Encienda la bomba de jeringa pequeña de Harvard y se deja correr por un minuto más. (Asegúrese de que no haya burbujas y no hay fugas en el dispositivo o en la tubería). Detener las bombas. El dispositivo de microfluidos ya está listo para ser utilizado.
- Retire la jeringa de 1 ml que contiene 1X PBS de la bomba de jeringa pequeña de Harvard.
- Después de obtener una muestra de sangre, llenar la jeringa de 1 ml con 0,05 ml de PBS estéril 1X sin atrapar las burbujas. A continuación, llenar la jeringa con 0,5 ml de sangre obtenida del tubo Eppendorf. (La jeringa de 1 ml contiene ahora un volumen final de 0,55 ml de la sangre y el tampón PBS 1X.) Nota: Mantenga la jeringa vertical, mientras que el llenado para evitar la mezcla de la PBS 0,05 ml de la sangre.
- Conecte la jeringa que contiene la sangre a la entrada 1 y montar la jeringa con cuidado (evitar empujar la sangre a través del tubo en el dispositivo) en la bomba de jeringa pequeña de Harvard (la jeringa se monta vertical en la bomba).
- Retire el tubo de salida del tubo de drenaje y poner un limpia tubo de 50 ml centrífuga en su lugar y lo puso en un cubo de hielo.
- Encienda la bomba de jeringa grande Harvard primero y deje que funcione durante 1 minuto. Comenzar a recoger la muestra de la desembocadura en el tubo de centrífuga de 50 ml.
- Encienda la bomba de jeringa pequeña de Harvard.
- Una vez que la muestra de sangre en la jeringa de 1 ml por completo ha viajado a través del dispositivo, deje de ambas bombas. Esto debería tomar unos 20 minutos.
- Centrifugar la muestra recogida durante 5 minutos a 350 xg a temperatura ambiente con el de freno.
- Aspirar el sobrenadante mediante la colocación de punta de la pipeta en el lado opuesto de la bolita blanca. Eliminar la mayor cantidad de residuos posible sobrenadante, las células, especialmente de color rojo, sin perturbar el precipitado blanco.
- Resuspender la muestra en 1 ml de buffer de flujo (1X PBS, BSA al 1% [albúmina de suero bovino], 2% PFA) pipeteando arriba y hacia abajo. Transferir la muestra a un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
- Microcentrífuga de la muestra recogida durante 5 minutos a 4 xg a temperatura ambiente. Use la misma precisión que antes para eliminar el sobrenadante.
- Resuspender la muestra en 1 ml de solución tampón de flujo de vórtice.
2.5 Preparación para el análisis de citometría de flujo
- Para el análisis de muestras mediante citometría de flujo, añadir 100 ml de muestra a un tubo de citometría de flujo.
- Para el l 100 de muestra, añadir anticuerpos específicos (asegurar la concentración correcta).
- Que la muestra de incubar durante 30 minutos a 40 C.
- Lavar dos veces con tampón de flujo antes de la citometría de flujo. Paso de lavado incluye la adición de 250 l de buffer de flujo, agitación, centrifugación durante 5 minutos a 350 xg, y eliminar el sobrenadante con el líquido a su vez uno de los tubos de citometría de flujo.
- Resuspender el precipitado en 250 l de tampón de flujo. Muestra está lista para el análisis por citometría de flujo.
Resultados representante
La sangre entera se ha ejecutado a través del dispositivo de microfluidos y el protocolo de lisis post-procesamiento, librar de los eritrocitos y el enriquecimiento que circulan las células nucleadas (CNC). Ideal resultados dará lugar a una citometría de flujo limpio diagrama de dispersión con poblaciones separadas CNC. Se muestra a continuación en las figuras 2 y 3 son las comparaciones gráfico de dispersión de una muestra de sangre entera sin lisis de los eritrocitos y con lisis de los eritrocitos por el protocolo de microfluidos con ejes como dispersión frontal (FSC) versus dispersión lateral (SSC) de luz. Se puede observar que el protocolo de enriquecimiento de microfluidos es necesario obtener una citometría de flujo limpio diagrama de dispersión.
Figura 2. La citometría de flujo diagrama de dispersión de la muestra de sangre entera sin lisis de los eritrocitos con el FSC y SSC ejes.
Figura 3. La citometría de flujo diagrama de dispersión de las células circulantes en núcleos lisis de microfluidos eritrocitos marcados por las poblaciones con el FSC y SSC ejes. Región 1 (rojo) representa los linfocitos, la Región 2 (verde) representa los monocitos, la Región 3 (azul) representa a los granulocitos, y la región 4 (morado) aún no se ha caracterizado.
Eliminación de restos de glóbulos rojos con una pipeta en el protocolo también es importante cuando es necesario. A continuación en la Figura 4 es un diagrama de dispersión que muestran un exceso de residuos de glóbulos rojos. A pesar de no empañar el diagrama de dispersión como en la figura 2, uno debe tener en cuenta los acontecimientos añadido debido a los escombros de eritrocitos durante el análisis de datos.
Figura 4. La citometría de flujo diagrama de dispersión que muestra restos de glóbulos rojos, visto como un grupode los acontecimientos en la Región 5 (azul).
Tinción de las células de ciertos marcadores de anticuerpos fenotipo también va a generar resultados característicos. En las figuras siguientes son las manchas de anticuerpos fenotipo de tres poblaciones de leucocitos diferentes: los linfocitos, monocitos y granulocitos. La Figura 5 muestra las poblaciones de linfocitos trazado de ejes CD3 y CD4. Monocitos y granulocitos se muestran en las figuras 6-7 con ejes como el FSC frente a CD14 y CD66b, respectivamente.
Figura 5. La citometría de flujo diagrama de dispersión que representan linfocitos CD3 y con ejes de CD4.
Figura 6. La citometría de flujo diagrama de dispersión que representa los monocitos con el FSC y ejes CD14.
Figura 7. Citometría de flujo diagrama de dispersión que representa granulocitos con el FSC y ejes CD66b.
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Discussion
Un sistema automatizado de protocolo de microfluidos lisis de sangre ha sido reportado. Dentro del protocolo son pasos críticos dignos de mención. En la sección P.2.1, es importante desechar el frasco de sangre recogen la primera vez que la muestra contiene desalojados células endoteliales maduras que actúan como falsos positivos. También asegúrese de ejecutar la muestra de sangre una hora después de la recolección. Cebado del dispositivo de microfluidos en el apartado P.2.2, es importante para librar al principio de las burbujas. Además, se debe evitar la introducción de burbujas al colocar jeringas nuevas a las agujas a través del protocolo. Al llenar la jeringa de 1 ml de sangre en el apartado P.2.4, hay que recordar que el primero tal vez 1X PBS y la sangre, a la vez que manteniendo la jeringa vertical para evitar la mezcla de las dos soluciones. Antes de comenzar la bomba de jeringa empujando la muestra de sangre, que la bomba jeringa grande ha estado funcionando por lo que el sistema es a toda velocidad. Después de la muestra ha terminado de ejecutarse a través del dispositivo y se centrifuga sido, retire con cuidado tanto sobrenadante como sea posible, incluidos los desechos de glóbulos rojos, sin perturbar el precipitado blanco. Por último, en el apartado P.2.5 seguir el protocolo del fabricante s de asegurar la correcta concentración de anticuerpos se añade a la muestra de 100 mL.
Aplicaciones del Protocolo de microfluidos son inmensas en la investigación clínica. Interrogar el estado inmune de un individuo en términos de la CNC genera información importante sobre el estado de salud y pueden ayudar al diagnóstico y comprensión de la patogénesis de la enfermedad. Acceso a estas poblaciones CNC mediante la recopilación de muestras de sangre es más fácil y más conveniente que los análisis de la expresión humana afectan a los tejidos tumorales. Para estudiar estas células nucleadas en la circulación de uno debe ser capaz de enriquecer a las poblaciones de otros componentes sanguíneos, incluyendo los eritrocitos, la función principal del dispositivo informó. Por lo tanto, estos estudios se beneficiarían mucho de el protocolo de lisis de sangre de microfluidos.
Importancia del protocolo de microfluidos emerge en términos de aplicaciones. Debido a que el enriquecimiento de células nucleadas es necesario en los estudios clínicos de sangre, un protocolo que requiere muy poca experiencia y mediada por el usuario los pasos que produce resultados claros y consistentes es importante. El protocolo de microfluidos asegura la consistencia a través de la automatización y la exposición controlada de las células para ambientes hostiles. Con la uniformidad entre los laboratorios clínicos, los datos serán directamente comparables [2].
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Acknowledgments
La investigación ha sido apoyado por el Premio Wallace H. Coulter Carrera Fundación principios de la investigación traslacional. Gracias a Tim Andrews, Hematología / Oncología Pediátrica, para ayudar con la recolección de muestras de sangre. También gracias al Dr. Sam Wellhausen, Core Citometría de flujo, James Graham Brown Cancer Center, en busca de ayuda con el funcionamiento de las muestras de citometría de flujo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | ||
| 30-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon tubing (.010" ID) | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000) | Harvard Apparatus | 702000 | |
| Syringe Pump (Harvard Pico Plus) | Harvard Apparatus | 702213 | |
| Flow cytometry tubes | DB Biosciences | 352052 | |
| Antibody stains | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | ||
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | ||
| 30 ml tube | Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
References
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
