Nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 Microfluidic 혈액 용해 프로토콜

Summary

자동 microfluidic 장치는 세포 손실없이 고품질의 샘플의 절연을 보장 적혈구 용해를 통해 말초 혈액에서 nucleated 세포 농축을 순환하기 위해 개발되었습니다.

Abstract

이 보고서에서는 자동 microfluidic 혈액 용해 장치에 대한 프로토콜 세부 있습니다. leukocytes과 내피 세포를 포함한 세포 nucleated (CNCs), 순환, 개인의 면역 상태에 업데이트 상태를 이상적인 플랫폼을 제공합니다. microfluidic 프로토콜은 선택적 세포 손실 및 사용자 중재 단계에 따라 샘플 준비 변화없이 CNCs의 농축을 허용합니다. 간단히, 프로토콜은 장치 제조, 샘플 수집, 장치 설치 및 microfluidic 챔버를 통해 혈액을 실행을 포함합니다. 장치 내의 모든 혈액이 빠르게 50 미크론 X 150 마이크론 microfluidic 채널에서 약 10 초 동안 탈이온수와 혼합됩니다. 이 시간에 걸쳐의 적혈구는 hypotonic 사정에 따라 lysed 있습니다. 채널의 하단에 헤링본 구조는 철저하게 혼합하고 지속적인 환경에 세포의 노출을 보장합니다. 남은 세포는 장치의 출구에서 isotonic 조건에 반환 2 % paraformaldehyde를 사용하여 고정 CNCs에서 적혈구 파편을 분리 centrifuged 및 유동세포계측법에 의해 얼룩 및 분석을위한 흐름 버퍼에 일시 중지됩니다. 결과 저장 CNC의 인구 깨끗한 유동세포계측법의 스캐터 플롯을 보여줍니다. 이 장치와 프로토콜의 의미는 CNC의 인구 분석하여 질병 pathogenesis의 연구 및 이해된다. 따라서 자동화, 효율성, 그리고 microfluidic 프로토콜의 단순는 증명하고 있습니다.

Protocol

1 부. Microfluidic 장치 제조

microfluidic 용해 장치의 실리콘 마스터 금형은 루이빌 청정실 대학에서 장비 표준 photolithographic 기술을 사용하여 만들어진 [1]. 의 AutoCAD는 (오토 데스크, 주식 회사, 산 라파엘, CA) 채널의 부정적인 복제본을 만듭니다 (Fineline 이미징, 콜로라도 스프링스, CO) 투명 마스크를 생성하기 위해 사용되었습니다. microfluidic 용해 장치는 탄성 폴리 (dimethylsiloxane) (; 다우 코닝, 미들랜드, MI PDMS)과 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 실리콘 마스터 금형에서 가공되었습니다. 복제된 채널과 탄성이 출시되었고, 채널 액세스 구멍은 20 게이지 바늘 (소형 부품, 미라, FL.)와 펀치되었습니다. PDMS 웨이퍼는 irreversibly 산소 플라즈마를 통해 유리 슬라이드에 보세 및 실험을위한 테스트되었습니다.

2 부. 용해 장치를 실행하기위한 프로토콜

microfluidic 장치가 조작된하고 테스트한 후, 적혈구 용해와 실험을 시작할 준비가되었습니다. microfluidic 장치에 대해 다음 섹션 자세한 내용은 프로토콜.

2.1 샘플 컬렉션

1. 이 두 ML 그린 ​​톱 vaccutainers에서 항응고제로 헤파린과 함께 환자의 앞쪽에 팔뚝의 정맥에서 중간 cubital 정맥에서 혈액 샘플 4 밀리리터를 수집합니다.
2. 그것이 dislodged 성숙 내피 세포 (잘못된 반응)가 들어 있으므로 처음 2 ML 튜브를 폐기하십시오.
3. 위아래로 돌려 의한 피로 헤파린를 섞어 두 번째 튜브를 Resuspend, 얼음에 즉시 저장합니다.
4. 1.5 ML Eppendorf 튜브에 혈액 1 ML을 전송합니다. (수집 한 시간 이내) 즉시 혈액 샘플을 처리합니다.

PBS와 2.2 프라임 microfluidic 장치

1. 유리 보세 microfluidic 장치를 구합니다. 인레츠 및 콘센트 (그림 1)에 약간 큰 직경의 보도 자료 - 적합한 액세스 튜브 (소형 부품, 미라, FL).
2. 마이크로 인터페이스에 매크로를 제공 인레츠의 각 튜브에 30 게이지 주사 바늘을 (소형 부품, 미라, FL) 연결합니다.
3. 1X PBS로 1 ML의 주사기를 기입하고 주사 바늘을 flicking하여 거품을 없애 있는지 확인하십시오. microfluidic 장치에 유입 1 PBS - 로드된 1 ML의 주사기를 연결합니다. 솔루션 입구 2 아웃 흐름까지 손으로 부드럽게 1X PBS가 들어있는 주사기를 밀어 후 즉시 표준 사무실 바인더 클립과 함께 입구 2 클램프
4. 유체가 microfluidics 장치의 배출구 포트를 이룰 때까지 1X PBS를 밀어 계속합니다. 솔루션 콘센트 밖으로 흐르는되면, 다른 바인더 클립과 아울렛 튜빙을 클램프.
5. 1X PBS가 입구 3 밖으로 흐르는 때까지 한 ML의 주사기를 믿고 계속하고, 다른 사무실 바인더 클립과 함께 입구 3 포트를 클램프. microfluidics 장치는 이제 완벽하게 준비하는 것입니다.

그림 1. 각 솔루션 및 콘센트에 대한 인레츠을 보여주는 장치의 도식.

주사기 펌프 및 솔루션의 2.3 준비

1. 펌프를 보정하려면 다음 단계를 따르십시오 :
   1. 대형 하버드 주사기 펌프 (하버드, PHD 2,000분의 22 부 # 702000)의 경우 : 22.5 mm, 유량 600 μl / 분에 직경 구성을 설정합니다.
   2. 작은 하버드 주사기 펌프 (하버드, 피코 플러스 파트 # 702213)의 경우 : 4.61 mm, 유량에 직경 구성을 설정 20 μl / 분.
2. 무균 탈이온수 한 30 ML의 주사기를 채우십시오. 이것은 50 ML 원뿔 관에서 직접 솔루션을 철수하여 수행할 수 있습니다. (주사기 라벨)
3. 9 단계에서 설명한 절차를 사용 2X 인산염 버퍼 - 호수 (PBS), 2 % paraformaldehyde (PFA)와 두 번째 30 ML의 주사기를 채우십시오. (주사기 라벨)
4. 9 단계에서 설명한 절차를 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 저장된 aliquots의 1X PBS로 1 ML의 주사기를 채우십시오.
5. 입구 2 30 ML 탈이온수 주사기와 입구 3 30 ML 2X PBS의 주사기 (튜브 또는 microfluidics 장치가 돈 t 트랩 거품 확인)에 연결합니다. 인레츠 2 3 아울렛 튜브의 클램프를 제거합니다. 입구 하나에 1X PBS 1 ML의 주사기를 연결합니다. , 액체와 주사기 바늘을 작성 주사기를 연결하고, 거품을 제거하기 위해 주사기 바늘을 flicking하여 거품을 도입하지 마십시오.

2.4 적혈구 용해

1. 아래 설명된 적절한 하버드 펌프에 주사기의 모든 설정 :
   1. 대형 하버드 주사기 펌프에 함께 두 30 ML 주사기를 (하나는 불임, 드 - 이온화된 물, 2X PBS, 2% PFA와 다른 포함) 설정합니다.
   2. 작은 하버드 주사기 펌프에 한 ML의 주사기 (1X PBS를 포함) 설정합니다.
   3. 폐기물 수집에있는 아울렛 튜빙을 (W로 표시됩니다 50 ML 원뿔 관 플레이스aste).
2. 대형 하버드 주사기 펌프 (30 ML 주사기)를 켜고하고 일분 실행하자. (아무 거품과 장치 또는 튜브에 없음 누수가 없는지 확인합니다.)
3. 작은 하버드 주사기 펌프를 켜고 그것이 추가로 잠시 동안 실행하자. (아무 거품과 장치 또는 튜브에 없음 누수가 없는지 확인합니다.) 펌프를 중지합니다. microfluidics 장치는 현재 사용할 수 준비가 된 것입니다.
4. 작은 하버드 주사기 펌프의 1X PBS를 포함하는 제 1 ML 주사기를 제거합니다.
5. 혈액 샘플을 얻기 후에, 모든 거품을 트래핑하지 않고 무균 1X PBS의 0.05 ML으로 한 ML의 주사기를 입력하십시오. 다음 Eppendorf 튜브에서 얻은 혈액의 0.5 ML로 주사기를 입력합니다. (1 ML의 주사기는 이제 혈액과 1X PBS 버퍼의 0.55 ML의 최종 볼륨을 포함합니다.) 참고 : 혈액과 0.05 ML PBS의 혼합 피하기 위해 작성하는 동안 주사기가 수직 유지.
6. 입구 1로 혈액이 들어있는 주사기를 연결하고 작은 하버드 주사기 펌프 (주사기가 펌프에 수직 탑재)에 (장치에 튜브를 통해 혈액을 밀어 않도록) 신중하게 주사기를 탑재합니다.
7. 폐기물 관에서 아울렛 튜브를 제거하고 그 자리에 깨끗한 50 ML의 원심 분리기 튜브를 넣고 얼음 양동이에 설정합니다.
8. 먼저 대형 하버드 주사기 펌프 스위치를 켜고 그것이 1 분 해보죠. 50 ML의 원심 관에 콘센트에서 샘플을 수집 시작합니다.
9. 작은 하버드 주사기 펌프를 전환합니다.
10. 제 1 ML의 주사기에서 혈액 샘플 완전히 장치를 통해 여행을하고 나면, 두 펌프를 중지합니다. 이것은 약 20 분 소요됩니다.
11. 브레이크 해제와 함께 실온에서 350 XG에서 5 분 동안 수집된 샘플을 원심 분리기.
12. 화이트 펠렛의 반대편에 피펫 팁을 배치 뜨는 제거합니다. 흰색 펠렛 방해하지 않고, 가능, 특히 붉은 세포 파편만큼 뜨는으로 제거합니다.
13. 그리고 아래로 pipetting하여 흐름 버퍼 1 ML (1X PBS, 1 % BSA [소 혈청 알부민], 2퍼센트 PFA)에 샘플을 Resuspend. 1.5 ML Eppendorf 튜브에 샘플을 전송합니다.
14. 상온 4 XG에서 5 분 Microcentrifuge 수집된 샘플을. 뜨는을 제거하기 전에 동일한 정밀도를 사용합니다.
15. vortexing하여 흐름 버퍼 1 ML의 샘플을 Resuspend.

흐름 cytometric 분석을위한 준비 2.5

1. 유동세포계측법를 사용하여 샘​​플의 분석을 위해, 유동세포계측법 튜브 샘플 100 μl를 추가합니다.
2. 시료의 100 μl하기 (정확한 농도를 위해) 특정 항체를 추가합니다.
3. 예제 C. 40 30 분 부화 허용
4. 이전 유동세포계측법에 흐름 버퍼와 함께 두 번 씻으십시오. 세척 단계는 흐름 버퍼 250 μl를 추가 vortexing, 350 XG에서 5 분 centrifuging 및 유동세포계측법 관 중 하나 유체 턴과 함께 뜨는 제거가 포함됩니다.
5. 흐름 버퍼 250 μl의 펠렛을 Resuspend. 샘플 유동세포계측법에 의해 분석이 가능합니다.

대표 결과

전체 혈액은 적혈구의 리딩과 풍부한 nucleated 세포 (CNCs)를 순환, microfluidic 용해 장치 및 후처리 프로토콜을 통해 실행되었습니다. 이상적인 결과는 별도의 CNC의 인구와 깨끗한 유동세포계측법의 스캐터 플롯을 얻을 것입니다. 그림 2와 3의 아래에 표시하는 것은 적혈구 용해하지 않고 앞으로 분산형 (FSC) 대 사이드 분산형 (SSC) 조명으로 축과 microfluidic 프로토콜에 의해 적혈구 용해와 전체 혈액 샘플의 스캐터 플롯 비교입니다. 이것은 microfluidic 농축 프로토콜 깨끗한 유동세포계측법의 산란 계획을 얻기 위해 필요하다고 볼 수 있습니다.

그림 2. FSC와 SSC의 축과 적혈구 용해하지 않고 전체 혈액 샘플의 유동세포계측법의 스캐터 플롯.

그림 3. FSC와 SSC의 축과 집단에 의해 표시 microfluidic 적혈구 용해와 nucleated 세포 순환의 유동세포계측법의 스캐터 플롯. 지역 1 (빨간색)은 granulocytes을 나타내는 지역 3 (파란색), 지역 2 (녹색)가 monocytes을 나타내는, lymphocytes을 대표하고, 지역 4 (보라색)이 특징으로 아직있다.

때 필요한 프로토콜에 피펫으로 붉은 세포 파편의 제거도 중요합니다. 아래 그림 4는 빨간색 세포 파편의 흑자를 보여주는 스캐터 플롯이다. 그림 2에서와 스캐터 플롯을 흐려 놨하지 않지만, 하나는 데이터 분석 중에 적혈구 파편으로 인한 추가 이벤트에 대한 계정이 있어야합니다.

그림 4. 유동세포계측법의 스캐터 줄거리는 클러스터로 본 붉은 세포 파편을 묘사한지역 5 (시안)에 이벤트.

특정 항체 표현형 마커에 대한 얼룩 세포는 특성 결과를 생성합니다. lymphocytes, monocytes, 그리고 granulocytes 다음 그림 3 뚜렷한 백혈구의 집단에 대한 항체 표현형의 얼룩이 있습니다. 그림 5는 도끼 인 경우에는 3 번 CD와 CD4 림프구와 제휴해서 역모 인구 모습. Monocytes와 granulocytes는 각각, FSC 대 CD14와 CD66b 같은 축과 6-7 그림에 표시됩니다.

그림 5. 유동세포계측법의 스캐터 플롯이 인 경우에는 3 번 CD와 CD4 도끼와 lymphocytes를 묘사.

그림 6. 유동세포계측법의 스캐터 플롯은 FSC와 CD14 축과 monocytes를 묘사.

그림 7. 유동세포계측법의 스캐터 플롯은 FSC와 CD66b 도끼와 granulocytes를 묘사.

Discussion

자동 microfluidic 혈액 용해 프로토콜이보고되었습니다. 프로토콜 내에서 협조할 중요한 단계입니다. 섹션 P.2.1에서는, 그것은 샘플 dislodged 성숙 내피 세포를 포함하고 잘못된 반응과 같은 역할을 모은 최초의 혈액 약병을 폐기하는 것이 중요합니다. 또한 수집 시간 이내에 혈액 샘플을 실행할 수 있는지 확인하십시오. 섹션 P.2.2에 마중물 microfluidic 장치를, 그것은 처음에 거품을 제거하는 것이 중요합니다. 또한, 하나는 프로토콜을 통해 바늘에 새로운 주사기를 장착하면 거품을 도입하지 않도록해야합니다. 섹션 P.2.4에 피로 한 ML의 주사기를 작성하면, 하나는 두 솔루션의 혼합을 피하기 위해 주사기가 수직 유지하면서 첫번째 1X PBS와 혈액, 모두를 추가하는 기억합니다. 혈액 샘플을 추진하고 주사기 펌프를 시작하기 전에, 시스템 전체 속도되도록 큰 주사기 펌프가 실행되어 있는지 확인합니다. 예제에서는 장치를 통해 실행이 완료하고 centrifuged되었습니다 후, 신중하게 흰색 펠렛 방해하지 않고, 붉은 세포 파편을 포함, 많은 뜨는 가능한 제거합니다. 마지막으로, 섹션 P.2.5에서 항체의 정확한 농도를 보장하기 위해 제조 업체의 프로토콜을 따라는 100 μL 시료에 추가됩니다.

microfluidic 프로토콜의 응용 프로그램은 임상 연구에 엄청난. CNCs의 관점에서 개인의 면역 상태를 심문하는 것은 건강 상태에 중요한 정보를 생성하고 질병 pathogenesis의 진단과 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 혈액 샘플 컬렉션을 통해 이러한 CNC의 인구에 접근하는 것은 종양 조직을 포함한 인간의 표현 분석보다 더 쉽고 편리합니다. 유통 하나에 해당 nucleated 세포를 검사하기 위해서는 적혈구, 보고된 장치의 기본 기능을 포함한 다른 혈액 구성 요소에서 인구를 풍요롭게 수 있어야합니다. 따라서, 이러한 연구 microfluidic 혈액 용해 프로토콜에서 크게 도움이됩니다.

microfluidic 프로토콜의 의미는 애플 리케이션의 측면에서 나온다. nucleated 세포 농축은 혈액의 임상 연구가 필요하기 때문에, 약간의 전문 지식과 명확하고 일관된 결과를 만들어 사용자가 중재 단계를 필요로하는 프로토콜이 중요합니다. microfluidic 프로토콜은 자동화 및 거친 환경에 세포의 통제 노출을 통해 일관성을 보장합니다. 임상 실험실 데이터 간의 균일도가 직접 비교 예정으로 [2].

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning
Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent	Dow Corning
30-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-301PL-25
Tygon tubing (.010" ID)	Small Parts, Inc.	TGY-010
20-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-201PL-25
Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000)	Harvard Apparatus	702000
Syringe Pump (Harvard Pico Plus)	Harvard Apparatus	702213
Flow cytometry tubes	DB Biosciences	352052
Antibody stains	DB Biosciences
1.5 ml Eppendorf tubes	Fisher Scientific	05-402-25
50 ml tube	Fisher Scientific
1 ml syringe	Fisher Scientific
30 ml tube	Fisher Scientific
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific
10X PBS	Fisher Scientific