Geautomatiseerde Microfluïdische Blood Lysis Protocol voor de verrijking van circulerende cellen met een kern

Summary

Een geautomatiseerde microfluïdische apparaat werd ontwikkeld voor het doen circuleren kernhoudende cel verrijking uit perifeer bloed via erythrocyten lysis dat de isolatie van hoge kwaliteit staal zorgt zonder cel verlies.

Abstract

In dit rapport het protocol voor een geautomatiseerde microfluïdische bloed lysis apparaat is gedetailleerd. Circulerende cellen met een kern (CNCs), waaronder leukocyten en endotheelcellen, bieden een ideaal platform voor een bijgewerkte status op het immuunsysteem conditie van een individu. De microfluïdische-protocol zorgt voor verrijking van CNCs zonder selectieve celverlies en monstervoorbereiding variabiliteit te wijten aan de gebruiker-gemedieerde stappen. Kortom, het protocol bevat apparaat fabricage, monsterneming, het apparaat instellen en het uitvoeren van bloed door de microfluïdische kamer. Binnen het apparaat vol bloed wordt snel vermengd met gedemineraliseerd water voor ongeveer 10 seconden in een 50 micron x 150 micron microfluïdische kanaal. In deze tijdspanne erytrocyten zijn te wijten aan hypotone voorwaarden gelyseerd. Visgraat-structuren op de bodem van het kanaal zorgen voor de grondige mengen en blootstelling van cellen aan een constante omgeving. Overige cellen worden teruggestuurd naar isotone omstandigheden bij de uitgang van het apparaat, bevestigd met 2% paraformaldehyde, gecentrifugeerd tot erythrocyten puin te scheiden van CNCs, en gesuspendeerd in flow buffer voor kleuring en analyse door flowcytometrie. De resultaten tonen schoon flowcytometrie puntgrafieken met opgeslagen CNC-populaties. Betekenis van dit apparaat en protocol komt in de studie en begrip van de ziekte pathogenese door de analyse van CNC-populaties. Vandaar dat automatisering, effectiviteit, en de eenvoud van de microfluïdische protocol aangetoond.

Protocol

Deel 1. Microfluïdische apparaat fabricage

Een silicium meester mal van de microfluïdische lysis apparaat is gemaakt met behulp van standaard fotolithografische technieken met de apparatuur in de Universiteit van Louisville cleanroom [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, San Rafael, CA) werd gebruikt om een ​​transparant masker te genereren (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) om de negatieve replica's van de kanalen te creëren. De microfluïdische lysis apparaat werd vervaardigd uit het silicium meester mal met behulp van zachte lithografische technieken met de elastomeer poly (dimethylsiloxaan) (PDMS, Dow Corning, Midland, MI). Het elastomeer met de gerepliceerde kanalen werd vrijgegeven, en het kanaal toegang gaten werden geponst met een 20-gauge naald (kleine onderdelen, Miramar, FL.). De PDMS wafer was onomkeerbaar gebonden aan een glasplaatje met behulp van zuurstof plasma en getest voor experimenten.

Deel 2. Protocol voor het uitvoeren van lysis apparaat

Na de microfluïdische apparaat is gefabriceerd en getest, experimenten met erytrocyten lysis zijn klaar om te beginnen. Het volgende hoofdstuk beschrijft de protocol voor de microfluïdische apparaat.

2.1 Monsterneming

1. Verzamel vier milliliter bloed uit mediaan cubitaal ader, op de voorste onderarm ader van de patiënt met heparine als antistollingsmiddel in twee 2 ml groene top vaccutainers.
2. Gooi eerste 2 ml buis als het verdreven rijpe endotheelcellen (false positives) bevat.
3. Resuspendeer de tweede buis te heparine mengen met het bloed door het draaien op en neer, op te slaan onmiddellijk op ijs.
4. Breng 1 ml van het bloed naar een 1,5 ml Eppendorf buis. Onmiddellijk verwerken van het bloedmonster (binnen een uur van de collectie).

2.2 Prime microfluïdische apparaat met PBS

1. Verkrijgen van een microfluïdische apparaat gebonden aan glas. Press-fit toegang buis (Small Parts, Miramar, FL) van iets grotere diameter in de inlaten en uitlaat (figuur 1).
2. Bevestig een 30-gauge naald (kleine onderdelen, Miramar, FL) om de slang op elk van de inhammen, die de macro naar micro-interface.
3. Vul een 1 ml spuit met 1X PBS en zorg ervoor om zich te ontdoen van de bubbels te krijgen door flicking de naald van de spuit. Sluit de PBS-loaded 1 ml spuit met inlaat 1 op de microfluïdische apparaat. Duw de spuit met de 1X PBS voorzichtig met de hand tot de oplossing stroomt uit inlaat 2, en dan onmiddellijk inlaat 2 klem met een standaard kantoor bindmiddel clip
4. Ga door het indrukken van de 1X PBS tot vloeistof bereikt de uitlaatpoort van de microfluidics apparaat. Zodra de oplossing stroomt uit het stopcontact, klem de afvoer buis met een ander bindmiddel clip.
5. Ga door het indrukken van de 1 ml spuit totdat de 1X PBS stroomt uit inlaat 3, en klem de inlaat 3 poort met een ander kantoor bindmiddel clip. Het microfluidics apparaat is nu volledig gevuld.

Figuur 1. Schema van het apparaat met inlaten voor respectievelijke oplossingen en stopcontact.

2.3 Voorbereiding van de spuit pompen en oplossing

1. Het ijken van de pompen als volgt te werk:
   1. Voor de grote Harvard injectiepomp (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702000): Stel de diameter configuratie naar 22,5 mm, debiet 600 pl / min.
   2. Voor de kleine Harvard spuit pomp (Harvard, Pico Plus Part # 702213): de diameter configuratie ingesteld op 4,61 mm, debiet 20 pl / min.
2. Vul een 30 ml spuit met steriel gedemineraliseerd water. Dit kan gedaan worden door de oplossing direct uit de 50 ml conische buis. (Label van de spuit)
3. Vul een tweede 30 ml spuit met 2X fosfaat-gebufferde-zoutoplossing (PBS), 2% paraformaldehyde (PFA) met behulp van de procedure die in stap 9. (Label van de spuit)
4. Vul een 1 ml spuit met 1X PBS van de fracties die in de 15 ml conische buizen, met behulp van de procedure die in stap 9.
5. Sluit de 30 ml gedeïoniseerd water spuit inlaat 2 en de 30 ml 2X PBS spuit op de inlaat-3 (zorg ervoor dat u don t val luchtbellen in de slang of microfluidics apparaat). Verwijder de klem van inhammen 2 en 3 en de uitlaat slang. Sluit de 1X PBS 1 ml spuit in inlaat 1. Voorkomen dat er luchtbellen door het vullen van de naald met vloeistof, het aansluiten van de spuit, en flicking de injectienaald om zich te ontdoen van de bubbels.

2.4 erytrocyten lysis

1. Zet alle van de spuiten op de juiste Harvard pompen zoals hieronder beschreven:
   1. Samen te stellen van de twee 30 ml spuiten (een met steriele, gedeïoniseerd water en de andere met 2X PBS, 2% PFA) op het grote Harvard injectiepomp.
   2. Stel de 1 ml spuit (met 1X PBS) op de kleine Harvard injectiepomp.
   3. Plaats de uitlaat slang in een afvalbak (50 ml conische buis die is voorzien waste).
2. Zet de grote Harvard spuitpomp (met de 30 ml spuiten) en laat het uit te voeren gedurende een minuut. (Zorg ervoor dat er geen bubbels en geen lekkage in het apparaat of in de slang).
3. Zet de kleine Harvard spuitpomp en laat het uit te voeren voor een extra minuut. (Zorg ervoor dat er geen bubbels en geen lekkage in het apparaat of in de slang). Stop de pompen. Het microfluidics apparaat is nu klaar om gebruikt te worden.
4. Verwijder de 1 ml spuit met 1X PBS van de kleine Harvard injectiepomp.
5. Na het verkrijgen van een bloedmonster, vul de 1 ml spuit met 0,05 ml van de steriele 1X PBS zonder trapping het even welke bellen. Vervolgens vult u de spuit met 0,5 ml bloed verkregen uit de Eppendorf tube. (De 1 ml spuit bevat nu een uiteindelijk volume van 0,55 ml van het bloed en 1X PBS-buffer.) Opmerking: Houd de spuit verticaal tijdens het vullen om te voorkomen dat het mengen van de 0,05 ml PBS met het bloed.
6. Sluit de spuit met het bloed naar een inlaat en zorgvuldig monteren van de spuit (vermijd duwen het bloed door de slang in het apparaat) op de kleine Harvard spuit pomp (de spuit verticaal is gemonteerd in de pomp).
7. Haal de uitlaat slang van het afval buis en zet een schone centrifugebuis van 50 ml op zijn plaats en zet hem op een emmer met ijs.
8. Eerste schakelaar op het grote Harvard spuitpomp en laat het uit te voeren gedurende 1 minuut. Beginnen met het verzamelen van het monster uit het stopcontact in de centrifugebuis van 50 ml.
9. Schakelaar op de kleine Harvard injectiepomp.
10. Zodra het bloedmonster in de 1 ml spuit volledig reisde door het apparaat, stop beide pompen. Dit duurt ongeveer 20 minuten.
11. Centrifugeer de verzamelde monster gedurende 5 minuten bij 350 xg bij kamertemperatuur met de rem af.
12. Verwijder de bovenstaande vloeistof door het plaatsen van pipetpunt aan de andere kant van de witte pellet. Verwijder zoveel supernatant mogelijk, vooral rode bloedcellen puin, zonder de witte pellet.
13. Resuspendeer het monster in 1 ml van flow buffer (1X PBS, 1% BSA [bovine serum albumine], 2% PFA) door en neer te pipetteren. Overdracht monster tot een 1,5 ml Eppendorf buis.
14. Microcentrifuge de verzamelde monster gedurende 5 minuten bij 4 xg bij kamertemperatuur. Gebruik dezelfde nauwkeurigheid als voorheen aan de supernatant te verwijderen.
15. Resuspendeer het monster in 1 ml van de stroming buffer door vortexen.

2.5 Voorbereiding voor flowcytometrische analyse

1. Voor sample analyse met behulp van flowcytometrie, voeg 100 ul van het monster aan een flow cytometrie buis.
2. Om de 100 pi van het monster toe te voegen aangegeven antilichaam (let op de juiste concentratie).
3. Laat monster gedurende 30 minuten incuberen bij 40 C.
4. Was twee keer met stroom buffer voorafgaand aan de flowcytometrie. Was de stap omvat het toevoegen van 250 ul van de stroming buffer, vortexen, centrifugeren gedurende 5 minuten bij 350 xg, en het verwijderen van supernatant met een vloeistof draai van flowcytometrie buis.
5. Resuspendeer de pellet in 250 ui van flow buffer. Monster is klaar voor analyse door flowcytometrie.

Representatieve resultaten

Volbloed is uitgevoerd door de microfluïdische lysis apparaat en post-processing protocol, bevrijden van erytrocyten en het verrijken van circulerende cellen met een kern (CNCs). Ideaal resultaten zullen opleveren een schone flow cytometrie scatterplot met aparte CNC-populaties. Hieronder weergegeven in de figuren 2 en 3 zijn spreidingsdiagram vergelijkingen van een volbloed monster zonder erytrocyten lysis en met erythrocyt lysis door de microfluïdische protocol met bijlen als voorwaartse verstrooiing (FSC) versus kant verstrooiing (SSC) licht. Het kan worden gezien dat de microfluïdische verrijking protocol is nodig om een ​​schone flow cytometrie scatterplot te verkrijgen.

Figuur 2. Flowcytometrie spreidingsdiagram van volbloedmonster zonder erytrocyten lysis met FSC en SSC assen.

Figuur 3. Flowcytometrie spreidingsdiagram van circulerende cellen met een kern met microfluïdische erythrocyt lysis gelabeld door populaties met een FSC en SSC assen. Regio 1 (rood) staat voor lymfocyten, Regio 2 (groen) staat voor monocyten, Regio 3 (blauw) staat voor granulocyten en regio 4 (paars) moet nog worden gekarakteriseerd.

Verwijdering van de rode bloedcellen puin met een pipet in het protocol is ook belangrijk wanneer dat nodig is. Hieronder in figuur 4 is een scatterplot met een overschot van de rode bloedcellen puin. Hoewel niet vertroebelt de scatterplot als in figuur 2, moet een rekening voor de extra gebeurtenissen te wijten aan erythrocyten afval tijdens de data-analyse.

Figuur 4. Flowcytometrie scatterplot beeltenis van rode bloedcellen puin, gezien als een clustervan de gebeurtenissen in regio 5 (cyaan).

Kleuring cellen voor bepaalde antilichamen fenotype markers zal genereren ook kenmerkende resultaten. In de volgende figuren zijn antilichamen fenotype vlekken voor 3 verschillende leukocyten populaties: lymfocyten, monocyten en granulocyten. Figuur 5 toont lymfocytenpopulaties geplot met bijlen CD3 en CD4. Monocyten en granulocyten worden getoond in de figuren 6-7 met bijlen als FSC-versus CD14 en CD66b, respectievelijk.

Figuur 5. Flowcytometrie scatterplot beeltenis van lymfocyten met CD3 en CD4 assen.

Figuur 6. Flowcytometrie scatterplot beeltenis van monocyten met FSC-en CD14-assen.

Figuur 7. Flowcytometrie scatterplot beeltenis van granulocyten met FSC-en CD66b assen.

Discussion

Een geautomatiseerde microfluïdische bloed lysis protocol is gemeld. Binnen het protocol zijn kritische stappen vermeldenswaard. In paragraaf P.2.1, is het belangrijk om verwijder de eerste bloed flacon verzameld als het monster verjaagd mature endotheelcellen als false positives. Zorg er ook voor om het bloedmonster draaien binnen een uur van de collectie. Het vullen van de microfluïdische apparaat in paragraaf P.2.2, is het belangrijk om in eerste instantie af van de belletjes. Bovendien moet men voorkomen dat er luchtbellen bij het bevestigen van nieuwe spuiten om de naalden in het gehele protocol. Bij het vullen van de 1 ml spuit met bloed in paragraaf P.2.4, moet men niet vergeten om eerst toe te voegen 1X PBS en het bloed, alle terwijl de spuit verticaal op mengsel van de twee oplossingen te vermijden. Voordat u de spuit pomp duwen het bloedmonster, zorgen voor de grote spuit pomp heeft gelopen, zodat het systeem op volle toeren. Nadat het monster is voltooid door het apparaat en was gecentrifugeerd, verwijder voorzichtig zoveel supernatant mogelijk, waaronder rode bloedcellen puin, zonder de witte pellet. Ten slotte, in paragraaf P.2.5 volgen de fabrikant s-protocol om de juiste concentratie van het antilichaam te verzekeren wordt toegevoegd aan de 100 ul monster.

Toepassingen van de microfluïdische protocol zijn enorm in klinisch onderzoek. Ondervragen van de immuunstatus van een individu in termen van CNCs genereert belangrijke informatie over de toestand van de gezondheid en kan helpen bij de diagnose en het begrip van de ziekte pathogenese. Toegang tot deze CNC bevolking door middel van bloedafname collectie is eenvoudiger en handiger dan menselijke expressie analyses met betrekking tot tumorweefsels. Om te onderzoeken van deze cellen met een kern in het verkeer moet men in staat zijn om de bevolking te verrijken vanuit andere bloedbestanddelen, met inbegrip erytrocyten, de primaire functie van de gerapporteerde apparaat. Daarom zou een dergelijke studies veel profijt hebben van de microfluïdische bloed lysis protocol.

Betekenis van de microfluïdische protocol naar voren in termen van applicaties. Omdat de kern cel verrijking nodig is in klinische studies van het bloed, een protocol vereist weinig expertise en user-gemedieerde stappen die heldere en consistente resultaten oplevert is belangrijk. De microfluïdische protocol zorgt voor consistentie door middel van automatisering en gecontroleerde blootstelling van cellen aan ruwe omgevingen. Met de uniformiteit tussen klinische laboratoria gegevens worden direct vergelijkbaar [2].

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning
Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent	Dow Corning
30-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-301PL-25
Tygon tubing (.010" ID)	Small Parts, Inc.	TGY-010
20-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-201PL-25
Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000)	Harvard Apparatus	702000
Syringe Pump (Harvard Pico Plus)	Harvard Apparatus	702213
Flow cytometry tubes	DB Biosciences	352052
Antibody stains	DB Biosciences
1.5 ml Eppendorf tubes	Fisher Scientific	05-402-25
50 ml tube	Fisher Scientific
1 ml syringe	Fisher Scientific
30 ml tube	Fisher Scientific
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific
10X PBS	Fisher Scientific