Automatiserad Mikroflödessystem Blod Lysis protokoll för anrikning av cirkulerande celler med kärnor

Summary

En automatiserad mikroflödessystem enhet har utvecklats för att pumpa runt kärnförsedda cell anrikning från perifert blod via erytrocyt lys som garanterar isolering av hög kvalitet prov utan cell förlust.

Abstract

I denna rapport protokollet för en automatiserad mikroflödessystem blod lys enheten är detaljerad. Cirkulerande celler med kärnor (CNC), inklusive leukocyter och endotelceller, ger en idealisk plattform för en uppdaterad status på immunförsvaret tillstånd en individ. Den mikroflödessystem protokollet tillåter anrikning av CNC-system utan selektiva cell förlust och provberedning variationer beroende på användarens-medierad steg. Kortfattat innehåller Protocol Device tillverkning, provtagning, Enhetsinställningar och köra blod genom mikroflödessystem kammaren. Inom enheten helblod snabbt blandas med avjoniserat vatten i ca 10 sekunder i en 50 micron x 150 micron mikroflödessystem kanal. I denna tidsperiod erytrocyter lyseras på grund av hypoton förhållanden. Herringbone strukturer på botten av kanalen säkerställa omsorgsfull blandning och exponering av celler med en konstant miljö. Resterande celler tillbaka till isoton förhållandena vid utgången av enheten, fast med 2% paraformaldehyd, centrifugeras för att separera erytrocyt skräp från CNC-system, och suspenderade i flödet buffert för färgning och analys med flödescytometri. Resultaten visar rena flödet tomter cytometry scatter med CNC sparade populationer. Betydelsen av denna enhet och protokoll levereras i studien och förståelse för sjukdomen patogenes genom analys av CNC-populationer. Därför är automatisering, effektivitet och enkelhet mikroflödessystem protokollet visade.

Protocol

Del 1. Mikroflödessystem Komponentframställning

En kisel mästare form av mikroflödessystem lys-enheten skapades med hjälp av vanliga fotolitografiska tekniker med utrustning i University of Louisville renrum [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, Kalifornien) användes för att generera en öppenhet mask (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) för att skapa negativa repliker av kanaler. Den mikroflödessystem lys enhet var tillverkat av kisel mästare formen med mjuka litografiska tekniker med elastomer poly (dimetylsiloxan) (PDMS, Dow Corning, Midland, MI). Den elastomer med den replikerade kanaler släpptes, och kanal tillgång hål stansades med en 20-nål (små delar, Miramar, FL.). De PDMS rån var irreversibelt bundna till en glasskiva via syre plasma och testas för experiment.

Del 2. Protokoll för löpning lys-enhet

Efter att mikroflödessystem enheten har tillverkats och testats, experiment med erytrocyt lys är redo att börja. I följande avsnitt beskriver det protokollet för mikroflödessystem enhet.

2,1 Provtagning

1. Samla 4 milliliter blod prov från median kubiska ven, på den främre underarmen ven av patient med heparin som antikoagulant i två 2 ml grön topp vaccutainers.
2. Kasta första 2 ml tub eftersom det innehåller rubbas mogna endotelceller (falska positiva).
3. Resuspendera andra röret för att blanda heparin med blod genom att vända upp och ner, spara på kylning omedelbart.
4. Överför 1 ml blod till ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Process blodprovet omedelbart (inom en timme efter insamling).

2,2 Prime mikroflödessystem enhet med PBS

1. Skaffa en mikroflödessystem enhet klistrat glas. Press-Fit tillgång slangar (små delar, Miramar, FL) av något större diameter i vikar och utlopp (figur 1).
2. Fäst en 30-gauge injektionsnål (små delar, Miramar, FL) i röret på varje inkast, som ger makro till mikro-gränssnitt.
3. Fyll en 1 ml spruta med 1X PBS och se till att få bort bubblorna genom att ställa sprutnålen. Anslut PBS-loaded 1 ml spruta till inloppet 1 på mikroflödessystem enhet. Skjut på sprutan innehållande 1X PBS försiktigt för hand tills lösningen rinner ut ur viken 2, och sedan omedelbart klämma inlopp 2 med en standard Office Binder klipp
4. Fortsätt att trycka på 1X PBS tills vätskan når utloppet av mikrofluidik enhet. När lösningen rinner ut ur vägguttaget, klämma utloppet rör med annat bindemedel klipp.
5. Fortsätt att trycka på 1 ml sprutan tills 1X PBS rinner ut inlopp 3, och klämma in-3-port med ett annat kontor bindemedel klipp. Den mikrofluidik Enheten är nu fullt laddad.

Figur 1. Schematisk av enhet visar inlopp för respektive lösningar och utlopp.

2,3 Beredning av sprutan pumpar och lösning

1. För att kalibrera pumpar så här:
   1. För den stora Harvard sprutpump (Harvard, PHD 22/2000 art.nummer 702 tusen): Ställ in diameter konfiguration till 22,5 mm, flöde 600 l / min.
   2. För det lilla Harvard sprutpump (Harvard, Pico Plus art.nummer 702.213): Ställ in diameter konfiguration till 4,61 mm, flöde 20 l / min.
2. Fyll en 30 ml spruta med sterilt avjoniserat vatten. Detta kan uppnås genom att dra den lösning direkt från 50 ml koniska rör. (Märk sprutan)
3. Fyll en andra 30 ml spruta med 2X fosfatbuffrad-saltlösning (PBS), 2% paraformaldehyd (PFA) med hjälp av proceduren som beskrivs i steg 9. (Märk sprutan)
4. Fyll en 1 ml spruta med 1X PBS från alikvoter lagras i 15 ml koniska rör med hjälp av proceduren som beskrivs i steg 9.
5. Anslut 30 ml avjoniserat vatten sprutan inlopp 2 och 30 ml 2X PBS sprutan till inlopp 3 (se till att du don t fånga bubblor i slangen eller mikrofluidik enhet). Ta bort klämman från inlopp 2 och 3 och utloppet slangen. Anslut 1X PBS 1 ml spruta in inlopp 1. Undvika att införa bubblor genom att fylla injektionsnålen med vätska, som förbinder sprutan, och rulla sprutan nål för att bli av med bubblor.

2,4 Erytrocyt lys

1. Ställ alla sprutor på rätt Harvard pumparna som anges nedan:
   1. Ställ in två 30 ml sprutor (en innehållande steril, avjoniserat vatten och den andra med 2X PBS, 2% PFA) tillsammans på den stora Harvard sprutpump.
   2. Ställ in 1 ml sprutan (som innehåller 1X PBS) på den lilla Harvard sprutpump.
   3. Placera utloppet slang i en insamlare (50 ml koniska rör som är märkt wAste).
2. Slå på stora Harvard sprutpump (med 30 ml sprutor) och låt den gå i en minut. (Se till att det inte finns några bubblor och inget läckage i enheten eller i slangen).
3. Slå på den lilla Harvard sprutpumpen och låt den löpa under ytterligare en minut. (Se till att det inte finns några bubblor och inget läckage i enheten eller i slangen). Stoppa pumparna. Den mikrofluidik Enheten är nu klar att användas.
4. Ta ut 1 ml spruta med 1X PBS från den lilla Harvard sprutpump.
5. Efter att ha fått ett blodprov, fylla 1 ml spruta med 0,05 ml sterilt 1X PBS utan fånga några bubblor. Därefter fyller sprutan med 0,5 ml blod som erhållits från Eppendorf-rör. (1 ml sprutan kommer nu att innehålla en slutlig volym på 0,55 ml av blod och 1X PBS-buffert.) Obs: Håll sprutan vertikalt när de fyller för att undvika blandning av 0,05 ml PBS med blodet.
6. Anslut sprutan innehåller blodet till inlopp 1 och montera sprutan försiktigt (undvik att trycka blodet genom slangen in i enheten) på den lilla Harvard sprutpump (sprutan är monterad vertikalt in i pumpen).
7. Ta bort utloppet slangen från avfallet röret och sätta en ren 50 ml centrifugrör på sin plats och satte den på en hink med is.
8. Slå på den stora Harvard sprutpumpen först och låt den gå i 1 minut. Börja samla provet från utlopp i 50 ml centrifugrör.
9. Slå på den lilla Harvard sprutpump.
10. När blodprov i 1 ml sprutan har helt rest genom enheten, sluta båda pumparna. Detta bör ta ca 20 minuter.
11. Centrifugera det insamlade provet i 5 minuter vid 350 xg vid rumstemperatur med bromsen avstängd.
12. Avlägsna supernatanten genom att placera pipettspetsen på motsatt sida av vit pellet. Ta bort så mycket supernatanten som möjligt, särskilt röda blodkroppar skräp utan att störa den vita pelleten.
13. Resuspendera provet i en 1 ml flöde buffert (1X PBS, 1% BSA [bovint serumalbumin], 2% PFA) genom att pipettera upp och ned. Överför provet till ett 1,5 ml Eppendorf-rör.
14. Mikrocentrifug det insamlade provet i 5 minuter vid 4 xg vid rumstemperatur. Använd samma precision som tidigare att avlägsna supernatanten.
15. Resuspendera provet i en 1 ml flöde buffert genom att vortexa.

2,5 Förberedelser för flödescytometrisk analys

1. För prov analys med flödescytometri, tillsätt 100 ìl av provet till ett flödescytometri rör.
2. Till 100 ìl av provet och tillsätt angivna antikropp (korrekt koncentration).
3. Låt provet inkubera i 30 minuter vid 40 C.
4. Tvätta två gånger med flödet buffert innan flödescytometri. Tvätta steg inkluderar att lägga till 250 l av flöde buffert, vortexa, centrifugering i 5 minuter vid 350 xg, och ta bort supernatanten med en vätska tur flödescytometri rör.
5. Återsuspendera pelleten i 250 l av flödet buffert. Exempel är redo för analys med flödescytometri.

Representativa resultat

Helblod har drivits igenom mikroflödessystem lys enheten och efterbearbetning protokollet, befria erytrocyter och berikande cirkulerande celler med kärnor (CNC). Idealisk Resultatet kommer att ge en ren flöde tomt cytometry scatter med separat CNC populationer. Visas nedan i figur 2 och 3 är punktdiagram jämförelser av ett helblodsprov utan erytrocyt lys och med erytrocyter lysering av mikroflödessystem protokoll med yxor som Forward Scatter (FSC) kontra sidospridning (SSC) ljus. Man kan se att mikroflödessystem anrikning protokollet är nödvändigt att få ett rent flöde tomt cytometry scatter.

Figur 2. Flödescytometri punktdiagram av helblod utan erytrocyt lys med FSC och SSC axlar.

Figur 3. Flödescytometri punktdiagram av cirkulerande kärnförsedda celler med mikroflödessystem erytrocyt lysering märkas av populationer med FSC och SSC axlar. Region 1 (röd) representerar lymfocyter, Region 2 (grön) representerar monocyter, Region 3 (blå) representerar granulocyter, och Region 4 (lila) har ännu inte beskrivas.

Borttagning av röda blodkroppar skräp med pipett i protokollet är också viktigt när det behövs. Nedan i Figur 4 är ett punktdiagram som visar ett överskott på röda blodkroppar skräp. Även om det inte grumling av punktdiagram som i figur 2, måste man stå för den extra händelser på grund av erytrocyt skräp under dataanalys.

Figur 4. Flödescytometri punktdiagram som visar röda blodkroppar skräp, ses som ett klusterav händelser i Region 5 (cyan).

Färgning celler för vissa markörer antikroppar fenotyp kommer också att generera karaktäristiska resultat. I följande figurer är antikroppar fenotyp fläckar i 3 olika leukocyt populationer: lymfocyter, monocyter och granulocyter. Figur 5 visar lymfocytpopulationer ritas med yxor CD3 och CD4. Monocyter och granulocyter visas i figurerna 6-7 med yxor som FSC kontra CD14 och CD66b, respektive.

Figur 5. Flödescytometri punktdiagram visar lymfocyter med CD3 och CD4 axlar.

Figur 6. Flödescytometri punktdiagram visar monocyter med FSC och CD14 axlar.

Figur 7. Flödescytometri punktdiagram visar granulocyter med FSC och CD66b axlar.

Discussion

En automatiserad mikroflödessystem blod lys-protokollet har rapporterats. I protokollet är kritiska steg värt att notera. I avsnitt P.2.1 är det viktigt att göra den första blod flaskan som samlats in som provet innehåller rubbas mogna endotelceller agerar som falska positiva. Se också till att driva blodprovet inom en timme efter provtagning. Kontroll av mikroflödessystem enheten i avsnitt P.2.2 är det viktigt att först bli av med bubblor. Dessutom bör man undvika att införa bubblor när du sätter nya sprutor till nålar hela protokollet. När du fyller på 1 ml sprutan med blod i avsnitt P.2.4 ska man komma ihåg att först lägga 1X PBS och blod, allt samtidigt hålla sprutan lodrätt för att undvika blandning av de två lösningarna. Före start sprutpumpen skjuta blodprov, se den stora sprutan pumpen har varit igång så att systemet är i full fart. Efter provet har körts genom enheten och varit centrifugeras, försiktigt bort så mycket supernatanten som möjligt, inklusive röda blodkroppar skräp utan att störa den vita pelleten. Slutligen, i avsnitt P.2.5 följa tillverkarens s protokoll för att säkerställa den korrekta koncentrationen av antikroppar läggs till de 100 mikroliter prov.

Tillämpningar av mikroflödessystem protokollet är enorma i klinisk forskning. Förhöra den immunstatus en individ i termer av CNC-system genererar viktig information under förutsättning av hälsa och kan hjälpa till med diagnos och förståelse för sjukdomen patogenes. Använda dessa CNC populationer genom blodprov samlingen är enklare och bekvämare än mänskligt uttryck analyser med tumörceller. För att undersöka dessa celler med kärnor i omlopp ett måste kunna berika befolkningen från andra blodkomponenter, inbegripet erytrocyter, den primära funktionen av de rapporterade enhet. Därför skulle sådana studier ha stor nytta av mikroflödessystem blodet lys-protokollet.

Betydelsen av mikroflödessystem protokollet framkommer i form av tillämpningar. Eftersom kärnförande cell anrikning krävs i kliniska studier av blod, är ett protokoll som kräver lite kunskap och användarvänlig medierad steg som ger tydliga och konsekventa resultat viktig. Den mikroflödessystem protokoll säkerställs konsekvens genom automatisering och kontrollerad exponering av celler för tuffa miljöer. Med enhetlighet mellan kliniska laboratorier data kommer att vara direkt jämförbara [2].

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning
Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent	Dow Corning
30-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-301PL-25
Tygon tubing (.010" ID)	Small Parts, Inc.	TGY-010
20-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-201PL-25
Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000)	Harvard Apparatus	702000
Syringe Pump (Harvard Pico Plus)	Harvard Apparatus	702213
Flow cytometry tubes	DB Biosciences	352052
Antibody stains	DB Biosciences
1.5 ml Eppendorf tubes	Fisher Scientific	05-402-25
50 ml tube	Fisher Scientific
1 ml syringe	Fisher Scientific
30 ml tube	Fisher Scientific
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific
10X PBS	Fisher Scientific