Summary
एक microfluidic डिवाइस स्वचालित एरिथ्रोसाइट lysis है कि सेल हानि के बिना उच्च गुणवत्ता का नमूना के अलगाव सुनिश्चित करता है के माध्यम से परिधीय रक्त से nucleated सेल संवर्धन परिसंचारी के लिए विकसित किया गया था.
Abstract
इस रिपोर्ट में एक स्वचालित microfluidic रक्त lysis डिवाइस के लिए प्रोटोकॉल विस्तृत है. Nucleated (CNCs) leukocytes और endothelial कोशिकाओं सहित कोशिकाओं परिसंचारी, एक व्यक्ति की प्रतिरक्षा शर्त पर एक अद्यतन स्थिति के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करते हैं. microfluidic प्रोटोकॉल चयनात्मक सेल घटाने और नमूना तैयार परिवर्तनशीलता उपयोगकर्ता की मध्यस्थता कदम के लिए कारण के बिना CNCs के संवर्धन के लिए अनुमति देता है. संक्षेप में, प्रोटोकॉल युक्ति छलरचना, नमूना संग्रह, युक्ति सेटअप, और microfluidic कक्ष के माध्यम से चल रहा रक्त शामिल हैं. डिवाइस के भीतर पूरे रक्त तेजी से एक 50 माइक्रोन x 150 माइक्रोन microfluidic चैनल में लगभग 10 सेकंड के लिए विआयनीकृत पानी के साथ मिश्रित है. इस समय अवधि एरिथ्रोसाइट्स hypotonic शर्तों के कारण lysed हैं. चैनल के तल पर herringbone संरचनाओं पूरी तरह से मिश्रण और एक निरंतर वातावरण में कोशिकाओं के जोखिम को सुनिश्चित करते हैं. शेष कोशिकाओं डिवाइस के बाहर निकलने पर isotonic शर्तों के लौट रहे हैं, का उपयोग कर 2% paraformaldehyde तय, CNCs एरिथ्रोसाइट मलबे से अलग centrifuged, और धुंधला हो जाना और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए प्रवाह बफर में निलंबित कर दिया. परिणाम स्वच्छ प्रवाह cytometry सीएनसी बचाया आबादी के साथ स्कैटर भूखंडों दिखा. इस डिवाइस और प्रोटोकॉल का महत्व अध्ययन और सीएनसी आबादी के विश्लेषण के द्वारा रोग के रोगजनन के समझ में आता है. इसलिए, स्वचालन, प्रभावशीलता, और microfluidic प्रोटोकॉल के सादगी का प्रदर्शन कर रहे हैं.
Protocol
भाग 1. Microfluidic युक्ति छलरचना
एक सिलिकॉन microfluidic lysis डिवाइस के मास्टर मोल्ड उपकरणों के साथ मानक photolithographic तकनीक का उपयोग कर Louisville cleanroom विश्वविद्यालय में बनाया गया था. [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, San Rafael, CA) के लिए एक पारदर्शिता मुखौटा उत्पन्न (Fineline इमेजिंग, Colorado Springs, CO) चैनलों की नकारात्मक प्रतिकृतियां बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. microfluidic lysis डिवाइस सिलिकॉन elastomer (dimethylsiloxane) पाली (, डॉव Corning, मिडलैंड, एमआई PDMS) के साथ मास्टर नरम lithographic तकनीक का उपयोग कर मोल्ड से निर्मित किया गया था. दोहराया चैनलों के साथ elastomer जारी किया गया था, और चैनल का उपयोग छेद एक 20 गेज सुई (लघु पार्ट्स, Miramar, FL.) के साथ छिद्रित किया गया. PDMS वफ़र अचल ऑक्सीजन प्लाज्मा के माध्यम से एक गिलास स्लाइड को बंधुआ और प्रयोग के लिए परीक्षण किया गया था.
भाग 2. Lysis डिवाइस को चलाने के लिए प्रोटोकॉल
बाद microfluidic युक्ति गढ़े किया गया है और परीक्षण, एरिथ्रोसाइट lysis के साथ प्रयोग करने के लिए शुरू करने के लिए तैयार हैं. microfluidic डिवाइस के लिए निम्न अनुभाग विवरण प्रोटोकॉल.
2.1 नमूना संग्रह
- मंझला cubital नस से खून का नमूना के 4 मिलीलीटर दो 2 मिलीलीटर हरी शीर्ष vaccutainers में anticoagulant रूप हेपरिन के साथ रोगी के पूर्वकाल प्रकोष्ठ नस पर, ले लीजिए.
- पहले 2 मिलीलीटर ट्यूब के रूप में इसे उखाड़ फेंकना परिपक्व endothelial कोशिकाओं (झूठी सकारात्मक) हैं त्यागें.
- दूसरी ट्यूब Resuspend खून से ऊपर और नीचे मोड़ द्वारा हेपरिन मिश्रण, बर्फ पर तुरंत बचाने.
- खून की एक मिलीलीटर एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब स्थानांतरण. रक्त के नमूने तुरंत प्रक्रिया (संग्रह के एक घंटे के के भीतर).
2.2 पीबीएस के साथ प्रधानमंत्री microfluidic युक्ति
- एक microfluidic डिवाइस कांच को बंधुआ प्राप्त करते हैं. प्रेस फिट inlets और आउटलेट (चित्रा 1) में थोड़ा बड़ा व्यास के उपयोग टयूबिंग (लघु पार्ट्स, Miramar, FL).
- Inlets में से प्रत्येक पर टयूबिंग के लिए एक सिरिंज 30 गेज सुई (लघु पार्ट्स, Miramar, FL) संलग्न, सूक्ष्म इंटरफ़ेस करने के लिए मैक्रो प्रदान.
- 1X पीबीएस के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें और सिरिंज सुई flicking द्वारा बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए सुनिश्चित करें. 1 प्रवेश करने के लिए microfluidic डिवाइस पर पीबीएस से भरी हुई एक मिलीलीटर सिरिंज कनेक्ट. 1X पीबीएस धीरे हाथ से जब तक समाधान 2 प्रवेश के बाहर बहती युक्त सिरिंज पुश, और फिर तुरंत एक मानक कार्यालय बांधने की मशीन क्लिप के साथ 2 इनलेट दबाना
- 1X पीबीएस धक्का जारी रखें जब तक तरल पदार्थ microfluidics डिवाइस के आउटलेट बंदरगाह तक पहुँचता है. एक बार समाधान के आउटलेट के बाहर बहती है, तो एक और बांधने की मशीन क्लिप के साथ आउटलेट टयूबिंग दबाना.
- 1 मिलीलीटर सिरिंज धक्का है जब तक 1X पीबीएस 3 प्रवेश के बाहर बहती जारी रखें, और एक कार्यालय बांधने की मशीन क्लिप के साथ प्रवेश 3 बंदरगाह दबाना. microfluidics युक्ति अब पूरी तरह से primed है.
चित्रा 1 आउटलेट के लिए संबंधित समाधान और inlets दिखा डिवाइस के योजनाबद्ध.
सिरिंज पंप और समाधान के 2.3 तैयारी
- पंप जांचना इन चरणों का पालन करें:
- बड़े हार्वर्ड सिरिंज पंप (हार्वर्ड, पीएचडी 22/2000 +७,०२,००० # हिस्सा): 22.5 मिमी, प्रवाह की दर में 600 μl / मिनट के लिए व्यास विन्यास सेट.
- छोटे हार्वर्ड सिरिंज पंप (हार्वर्ड, पिको प्लस 702213 # भाग): 4.61 मिमी, प्रवाह दर व्यास विन्यास सेट में 20 μl / मिनट.
- बाँझ विआयनीकृत जल के साथ एक 30 मिलीलीटर सिरिंज भरें. यह समाधान 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से सीधे वापस लेने के द्वारा पूरा किया जा सकता है. (लेबल सिरिंज)
- 2X फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस), 2% (पीएफए) paraformaldehyde चरण 9 में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग कर के साथ एक दूसरे 30 मिलीलीटर सिरिंज भरें. (लेबल सिरिंज)
- 1X पीबीएस के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में संग्रहीत aliquots से 1 मिलीलीटर सिरिंज, चरण 9 में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग कर भरें.
- 30 मिलीलीटर पानी विआयनीकृत 2 प्रवेश करने के लिए सिरिंज और 30 मिलीलीटर 2X पीबीएस 3 प्रवेश करने के लिए सिरिंज (यकीन है कि आप टयूबिंग या युक्ति microfluidics में टी डॉन जाल बुलबुले बनाने के लिए) कनेक्ट. 2 inlets और 3 और आउटलेट टयूबिंग से दबाना निकालें. 1 प्रवेश में पीबीएस 1X 1 मिलीलीटर सिरिंज कनेक्ट. तरल के साथ सिरिंज सुई भरने, सिरिंज जोड़ने, और सिरिंज सुई flicking बुलबुले से छुटकारा द्वारा बुलबुले शुरू करने से बचें.
2.4 एरिथ्रोसाइट lysis
- उचित हार्वर्ड के रूप में नीचे उल्लिखित पंपों पर सीरिंज के सभी सेट है:
- बड़े हार्वर्ड सिरिंज पंप पर दो 30 मिलीलीटर सीरिंज (एक बाँझ, de-ionized पानी और 2X पीबीएस, पीएफए 2% के साथ अन्य युक्त) के साथ सेट.
- 1 छोटे हार्वर्ड सिरिंज पंप पर मिलीलीटर सिरिंज (1X पीबीएस युक्त) सेट.
- बर्बादी कलेक्टर में आउटलेट टयूबिंग (50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कि w लेबल है प्लेसaste).
- बड़े हार्वर्ड सिरिंज पंप (30 मिलीलीटर सीरिंज के साथ) पर मुड़ें और इसे एक मिनट के लिए चलाने हैं. (यकीन है कि वहाँ कोई बुलबुले और डिवाइस में या टयूबिंग में कोई रिसाव हैं).
- छोटे हार्वर्ड सिरिंज पंप पर मुड़ें और एक अतिरिक्त मिनट के लिए इसे चलाने. (यकीन है कि वहाँ कोई बुलबुले और डिवाइस में या टयूबिंग में कोई रिसाव हैं). पंप बंद करो. microfluidics डिवाइस के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है.
- 1 मिलीलीटर सिरिंज छोटे हार्वर्ड सिरिंज पंप से 1X पीबीएस युक्त निकालें.
- एक खून का नमूना प्राप्त करने के बाद, बाँझ 1X पीबीएस के 0.05 मिलीलीटर के साथ किसी भी बुलबुले को फँसाने के बिना 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें. अगला, Eppendorf ट्यूब से प्राप्त रक्त के 0.5 मिलीलीटर के साथ सिरिंज भरें. (1 मिलीलीटर सिरिंज अब रक्त और 1X PBS बफर के 0.55 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में शामिल होंगे.) नोट: सिरिंज खड़ी रखें, जबकि 0.05 मिलीलीटर पीबीएस के रक्त के साथ मिश्रण से बचने के भरने.
- 1 प्रवेश करने के लिए रक्त युक्त सिरिंज कनेक्ट और सिरिंज ध्यान से छोटे हार्वर्ड सिरिंज पंप (सिरिंज पंप में खड़ी मुहिम शुरू की है) पर (टयूबिंग के माध्यम से डिवाइस में रक्त धक्का से बचने के लिए) माउंट.
- बेकार ट्यूब से आउटलेट टयूबिंग निकालें और अपनी जगह में एक साफ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब डाल दिया है और यह बर्फ की एक बाल्टी पर सेट.
- पहले बड़े हार्वर्ड सिरिंज पंप पर स्विच और इसे 1 मिनट के लिए चला. आउटलेट से 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में नमूना एकत्रित शुरू करो.
- छोटे हार्वर्ड सिरिंज पंप पर स्विच.
- एक बार 1 मिलीलीटर सिरिंज में खून का नमूना पूरी तरह से डिवाइस के माध्यम से कूच किया है, दोनों पंप बंद करो. यह लगभग 20 मिनट लग चाहिए.
- 5 मिनट के लिए ब्रेक के साथ बंद कमरे के तापमान पर 350 XG पर एकत्र नमूना अपकेंद्रित्र.
- सफेद गोली के विपरीत पक्ष में पिपेट टिप रखकर सतह पर तैरनेवाला निकालें. ज्यादा संभव हो, विशेष रूप से लाल कोशिका मलबे के रूप में सतह पर तैरनेवाला के रूप में सफेद गोली परेशान बिना निकालें.
- प्रवाह बफर के 1 मिलीग्राम (1X Pbs, 1% BSA [गोजातीय सीरम albumin], 2% पीएफए) में ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नमूना Resuspend. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब नमूना स्थानांतरण.
- कमरे के तापमान पर 4 XG पर 5 मिनट के लिए नमूना एकत्र Microcentrifuge. एक ही सटीक प्रयोग पहले के रूप में सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए.
- प्रवाह बफर के 1 मिलीलीटर में vortexing द्वारा नमूना Resuspend.
प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए 2.5 तैयारी
- नमूना प्रवाह cytometry का उपयोग विश्लेषण के लिए, एक प्रवाह cytometry ट्यूब के लिए नमूने के 100 μl जोड़ें.
- नमूना के 100 μl के लिए निर्दिष्ट एंटीबॉडी जोड़ने (सही एकाग्रता सुनिश्चित).
- नमूना 30 मिनट के लिए 40 पर सी. सेते दें
- प्रवाह प्रवाह cytometry पहले बफर के साथ दो बार धोएं. धो कदम प्रवाह बफर के 250 μl जोड़ने, vortexing, 350 XG में 5 मिनट के लिए centrifuging, और प्रवाह cytometry ट्यूब के एक द्रव बारी के साथ सतह पर तैरनेवाला हटाने शामिल हैं.
- प्रवाह बफर के 250 μl में गोली Resuspend. नमूना विश्लेषण के लिए प्रवाह cytometry द्वारा तैयार है.
प्रतिनिधि परिणाम
पूरे रक्त microfluidic lysis डिवाइस और प्रोटोकॉल पोस्ट प्रोसेसिंग के माध्यम से चला गया है, एरिथ्रोसाइट्स के मुक्त और समृद्ध nucleated कोशिकाओं (CNCs) परिसंचारी. आदर्श परिणाम अलग सीएनसी आबादी के साथ एक स्वच्छ प्रवाह cytometry तितर बितर साजिश निकलेगा. आंकड़े 2 और 3 में नीचे प्रदर्शित एरिथ्रोसाइट lysis के बिना और अक्ष के साथ आगे तितर बितर (FSC) बनाम ओर तितर बितर (एसएससी) प्रकाश के रूप में प्रोटोकॉल द्वारा microfluidic एरिथ्रोसाइट lysis के साथ स्कैटर एक पूरे रक्त के नमूने की साजिश की तुलना कर रहे हैं. यह देखा जा सकता है कि microfluidic संवर्धन प्रोटोकॉल के लिए एक साफ प्रवाह cytometry तितर बितर साजिश प्राप्त करने के लिए आवश्यक है कर सकते हैं.
चित्रा 2. FSC और एसएससी अक्षों के साथ एरिथ्रोसाइट lysis के बिना प्रवाह cytometry पूरे रक्त के नमूने के तितर बितर साजिश है.
चित्रा 3 microfluidic एरिथ्रोसाइट FSC और एसएससी अक्षों के साथ आबादी द्वारा लेबल lysis के साथ nucleated कोशिकाओं परिसंचारी के प्रवाह cytometry तितर बितर साजिश. क्षेत्र 1 (लाल) लिम्फोसाइटों का प्रतिनिधित्व करता है, 2 क्षेत्र (हरा) monocytes का प्रतिनिधित्व करता है, क्षेत्र 3 (नीला) granulocytes का प्रतिनिधित्व करता है, और अभी तक क्षेत्र 4 (बैंगनी) लक्षण वर्णन किया जा.
लाल कोशिका मलबे के प्रोटोकॉल में पिपेट द्वारा निकालना भी महत्वपूर्ण है जब आवश्यक है. चित्रा 4 में नीचे एक तितर बितर साजिश दिखा लाल सेल मलबे के एक अधिशेष है. हालांकि चित्रा 2 के रूप में तितर बितर साजिश झाई युक्त नहीं है, एक जोडी डेटा विश्लेषण के दौरान एरिथ्रोसाइट मलबे की वजह से घटनाओं के लिए खाते चाहिए.
चित्रा 4. प्रवाह cytometry तितर बितर साजिश लाल सेल मलबे, एक क्लस्टर के रूप में देखा चित्रण5 क्षेत्र (सियान) में घटनाओं की.
कुछ एंटीबॉडी phenotype मार्करों के लिए धुंधला कोशिकाओं को भी विशेषता परिणाम उत्पन्न होगा. Lymphocytes, monocytes, और granulocytes: निम्नलिखित आंकड़े में 3 अलग ल्युकोसैट आबादी के लिए एंटीबॉडी phenotype दाग रहे हैं. चित्रा 5 लिम्फोसाइट CD3 कुल्हाड़ियों और सीडी 4 के साथ प्लॉट किए जाते आबादी दर्शाया गया है. Monocytes और granulocytes FSC बनाम CD14 और CD66b के रूप में अक्ष के साथ 6-7 आंकड़े में दिखाया गया है क्रमशः.
चित्रा 5 फ्लो cytometry तितर बितर साजिश CD3 और सीडी 4 अक्षों के साथ चित्रण लिम्फोसाइटों .
चित्रा 6 प्रवाह cytometry तितर बितर साजिश FSC और CD14 अक्षों के साथ monocytes चित्रण.
7 चित्रा प्रवाह cytometry तितर बितर साजिश FSC और CD66b अक्षों के साथ granulocytes चित्रण.
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Discussion
एक स्वचालित microfluidic रक्त lysis प्रोटोकॉल बताया गया है. प्रोटोकॉल के भीतर टिप्पण लायक महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. P.2.1 अनुभाग में, यह महत्वपूर्ण है कि पहली रक्त नमूना उखाड़ फेंकना परिपक्व endothelial कोशिकाओं शामिल झूठी सकारात्मक रूप में अभिनय के रूप में एकत्र शीशी त्यागें. इसके अलावा संग्रह के एक घंटे के के भीतर खून का नमूना चलाने के लिए सुनिश्चित करें. P.2.2 अनुभाग में microfluidic युक्ति भड़काना, यह महत्वपूर्ण है शुरू में बुलबुले से छुटकारा. इसके अतिरिक्त, एक बुलबुले शुरू जब प्रोटोकॉल भर में सुई के लिए नए सिरिंजों संलग्न बचना चाहिए. जब P.2.4 अनुभाग में रक्त के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज को भरने, एक करने के लिए पहली 1X पीबीएस और रक्त, सभी जोड़ने जबकि सिरिंज के लिए दो समाधान के मिश्रण से बचने के ऊर्ध्वाधर रखने के लिए याद रखना चाहिए. सिरिंज पंप खून का नमूना धक्का शुरू करने से पहले सुनिश्चित करने के लिए, तो बड़े सिरिंज पंप प्रणाली पूरी रफ्तार से चल रहा है. बाद नमूना डिवाइस के माध्यम से चल रहा समाप्त हो गया है और किया गया centrifuged, ध्यान के रूप में सतह पर तैरनेवाला जितना संभव निकालने के लिए, लाल कोशिका मलबे सहित सफेद गोली परेशान बिना. अन्त में, P.2.5 अनुभाग में निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए एंटीबॉडी के सही एकाग्रता आश्वासन 100 μL नमूना में जोड़ा जाता है.
Microfluidic प्रोटोकॉल के आवेदन नैदानिक अनुसंधान के क्षेत्र में अपार हैं. CNCs के मामले में एक व्यक्ति की प्रतिरक्षा स्थिति पूछताछ स्वास्थ्य की शर्त पर महत्वपूर्ण जानकारी उत्पन्न करता है और रोग के रोगजनन के निदान और समझ के साथ मदद मिल सकती है. रक्त के नमूने संग्रह के माध्यम से इन सीएनसी आबादी तक पहुँचने आसान और मानव अभिव्यक्ति ट्यूमर ऊतकों को शामिल विश्लेषण की तुलना में अधिक सुविधाजनक है. एक परिसंचरण में इन nucleated कोशिकाओं की जांच करने के लिए एरिथ्रोसाइट्स रिपोर्ट डिवाइस के प्राथमिक समारोह सहित अन्य रक्त घटकों से आबादी को समृद्ध करने में सक्षम होना चाहिए. इसलिए, इस तरह के अध्ययन को बहुत microfluidic रक्त lysis प्रोटोकॉल से लाभ होगा.
Microfluidic प्रोटोकॉल के महत्व अनुप्रयोगों के मामले में उभर रहे हैं. क्योंकि nucleated सेल संवर्धन रक्त के नैदानिक अध्ययन में आवश्यक है, एक थोड़ा विशेषज्ञता और उपयोगकर्ता की मध्यस्थता कदम है कि साफ और सुसंगत परिणाम का उत्पादन की आवश्यकता होती है प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है. microfluidic प्रोटोकॉल स्वचालन और कठोर वातावरण के लिए कोशिकाओं की नियंत्रित जोखिम के माध्यम से स्थिरता सुनिश्चित करता है. नैदानिक प्रयोगशालाओं डेटा के बीच एकरूपता के साथ सीधे तुलनीय जाएगा. [2]
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Acknowledgments
अनुसंधान translational अनुसंधान में वैलेस एच. कल्टर फाउंडेशन जल्दी कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया. रक्त के नमूने संग्रह के साथ मदद के लिए टिम एन्ड्रयूज़, बाल चिकित्सा रुधिर / कैंसर विज्ञान, के लिए धन्यवाद. इसके अलावा डा. सैम Wellhausen, फ्लो Cytometry कोर, जेम्स ग्राहम प्रवाह cytometry के नमूने को चलाने के साथ मदद के लिए ब्राउन कैंसर केंद्र के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | ||
| 30-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon tubing (.010" ID) | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000) | Harvard Apparatus | 702000 | |
| Syringe Pump (Harvard Pico Plus) | Harvard Apparatus | 702213 | |
| Flow cytometry tubes | DB Biosciences | 352052 | |
| Antibody stains | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | ||
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | ||
| 30 ml tube | Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
References
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
