Summary
自動化されたマイクロ流体デバイスは、セルの損失なしで高品質のサンプルの分離を確実に溶血を経由して末梢血からの有核細胞の濃縮を循環させるために開発されました。
Abstract
この報告書では自動化されたマイクロ流体血液溶解装置用プロトコルが詳しく説明されています。白血球と内皮細胞を含む有核細胞（のCNC）、循環、個々の免疫状態に関する更新状況のための理想的なプラットフォームを提供します。マイクロ流体のプロトコルは、選択的な細胞の損失と、ユーザーが介在するステップによる試料調製の変動なしでCNCの濃縮が可能になります。簡単に言えば、プロトコルは、デバイス作製、サンプルの収集、デバイスのセットアップ、およびマイクロ流体チャンバーを介して血液を実行しているが含まれています。デバイス内で全血は急速に50ミクロン× 150ミクロンマイクロ流体チャネル内の約10秒間、脱イオン水と混合される。この時点ではスパンの赤血球は低張条件により可溶化されています。チャネルの底部のヘリンボーン構造が完全に混合し、一定の環境への細胞の露出を確認してください。残りの細胞は、装置の出口で等張条件に戻さ2％のパラホルムアルデヒドを用いて固定し、CNCのから赤血球残骸を分離する遠心分離し、フローサイトメトリーによる染色と分析のために流れの緩衝液に懸濁している。結果は保存されているCNC人口クリーンフローサイトメトリーの散布図を示す。このデバイスとプロトコルの重要性は、CNCの個体群の解析による疾患の病因の研究と理解に来る。したがって、自動化、有効性、およびマイクロ流体プロトコルのシンプルさが実証されています。
Protocol
パート1。マイクロ流体デバイスの製作
マイクロ流体の溶解装置のシリコンのマスターの金型はルイビルクリーンルームの大学での機器で標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して作成された[1]。 AutoCADは（オートデスク株式会社、サンラファエル、カリフォルニア州）チャネルの負のレプリカを作成する（輝いているイメージング、コロラドスプリングズ、コロラド州）透明度のマスクを生成するために使用されていました。マイクロ流体の溶解装置は、エラストマー、ポリ（ジメチルシロキサン）（ダウコーニング、ミッドランド、MI PDMS）とソフトリソグラフィ技術を用いてシリコンマスター金型から製造された。複製されたチャネルを持つエラストマーがリリースされ、チャネルのアクセスホールは、20ゲージの針（スモールパーツ、ミラマー、フロリダ州。）でパンチされた。 PDMSのウェハは、不可逆的に酸素プラズマを介してスライドガラスに接着し、実験のためにテストされています。
パート2。溶解装置を実行するためのプロトコル
マイクロ流体デバイスを作製し、テストされた後、赤血球溶解の実験では、開始する準備が整います。次のセクションでは、マイクロ流体デバイスのためのプロトコル。
2.1サンプル集
- two 2ミリリットル緑トップvaccutainersの抗凝固剤としてヘパリンを持つ患者の前腕の静脈に、肘正中皮静脈から血液サンプルの4ミリリットルを収集する。
- それが外れ成熟した内皮細胞を（偽陽性）が含まれているとして、最初の2 mlチューブを捨てる。
- 上下に回すことで血液とヘパリンを混合する第2のチューブを再懸濁し、氷上に即座に保存。
- 1.5mlのエッペンドルフチューブへの血液の1 mlを入れる。 （コレクションの一時間以内）に血液サンプルを処理します。
PBS 2.2総理マイクロ流体デバイス
- ガラスに結合マイクロ流体デバイスを取得します。入口と出口で少し大きめの直径（図1）の圧入アクセスチューブ（スモールパーツ、ミラマー、フロリダ州）。
- ミクロマクロをインターフェイスに提供し、入口の各チューブに30ゲージの注射針を（小さな部品、ミラマー、フロリダ州）に取り付けます。
- 1X PBSで1 mlのシリンジを記入し、シリンジの針をフリックで気泡を取り除くために確認してください。マイクロ流体デバイスの入口1にPBS -ロードされた1 mlのシリンジを接続してください。解決策は、入口2から流れ出すまで、手で軽く1X PBSを含む注射器を押し込み、すぐに標準的なオフィスバインダークリップで口2をクランプ
- 流体がマイクロ流体デバイスの出口ポートに到達するまで、1X PBSを押し続けます。解決策は、コンセントから流れ出すと、別のバインダークリップでアウトレットチューブをクランプする。
- 1X PBSが口3から流出するまで、1 mlのシリンジを押し続けると、別のOfficeバインダークリップで口3ポートをクランプする。マイクロ流体デバイスは、今や完全に準備されている。
図1の各ソリューションとコンセントのための入口を示す装置の概略図。
シリンジポンプとソリューション2.3準備
- ポンプのキャリブレーションを行うには、次の手順を実行します。
- 大規模なハーバードのシリンジポンプ（ハーバード大学、PHD 2000分の22の部品番号702000）の場合：22.5ミリメートル、流量600μL/ minのためにDiameterコンフィグレーションを設定します。
- 小さなハーバードのシリンジポンプ（ハーバード大学、ピコプラス部品番号702213）の場合：4.61ミリメートル、流速20μL/ minにDiameterコンフィグレーションを設定します。
- 滅菌脱イオン水を使用すると、ワン30mlのシリンジを埋める。これは、50 mlコニカルチューブから直接解決策を引き出すことによって達成することができます。 （注射器にラベルを付ける）
- 手順9で説明した手順を使用して、2Xリン酸緩衝-生理食塩水（PBS）、2％パラホルムアルデヒド（PFA）で2 30mlのシリンジを埋める。 （注射器にラベルを付ける）
- 手順9で説明した手順を使用して、15 mlコニカルチューブに格納されたアリコートから1X PBSで1 mlの注射器を埋める。
- 入口2と入口3〜30ミリリットル2X PBSのシリンジに30 mLの脱イオン水のシリンジを接続し（チューブまたはマイクロ流体デバイスで使用するドンtのトラップの気泡を確認してください）。入口2と3とアウトレットチューブからクランプを外します。入口1に1X PBSを1mlのシリンジを接続してください。 、液体を注射器の針を充填シリンジを接続し、気泡を除去するために注射針をフリックで気泡を導入することは避けてください。
2.4赤血球溶解
- 以下に概説されるよう適切なハーバードポンプのシリンジのすべてを設定します。
- 大規模なハーバードのシリンジポンプに一緒に2つの30 mLシリンジ（1つ滅菌、脱イオン水と2X PBS、2％PFAで他を含む）を設定します。
- 小さなハーバードのシリンジポンプに1 mlの注射器を（1X PBSを含む）を設定します。
- 廃棄物のコレクターでアウトレットチューブを置きます（Wラベル付けされている50 mlコニカルチューブASTE）。
- 大規模なハーバードのシリンジポンプ（30 mLシリンジ付き）をオンにして、それを1分間実行してみましょう。 （は泡とデバイスまたはチューブのない漏れがないことを確認してください）。
- 小さなハーバードのシリンジポンプの電源を入れ、追加分のために実行してみましょう。 （は泡とデバイスまたはチューブのない漏れがないことを確認してください）。ポンプを停止します。マイクロ流体デバイスは使用可能な状態になります。
- 小さなハーバードのシリンジポンプから1X PBSを含む1 mlのシリンジを取り外します。
- 血液サンプルを取得した後、気泡をトラップすることなく、滅菌1X PBSの0.05 mlを1 mlの注射器を埋める。次に、エッペンドルフチューブから得られた血液0.5mlをシリンジを埋める。 （1 mlの注射器は血液と1 × PBS緩衝液の0.55 mlの最終容量が含まれます。） 注 ：血液、0.05 mlのPBSの混合を避けるために充填しながら注射器を垂直に保つ。
- 入口1に血液を含有する注射器を接続し、小さなハーバードのシリンジポンプ（シリンジをポンプに垂直マウントされている）上（装置にチューブを介して血液を押し避ける）慎重にシリンジをマウントします。
- 廃液チューブからアウトレットチューブを取り外し、その場所に新しい50 ml遠心チューブに入れ、氷のバケツの上に置いてください。
- 最初の大ハーバードのシリンジポンプのスイッチを入れ、それが1分間実行してみましょう。 50 ml遠心チューブにコンセントからのサンプルの収集を開始します。
- 小さなハーバードシリンジポンプのスイッチを入れる。
- 1mlの注射器で血液サンプルが完全にデバイスを通過するとしたら、両方のポンプを停止する。これは約20分かかります。
- ブレーキオフ、室温で350 xgで5分間採取した試料を遠心分離します。
- 白色ペレットの反対側にピペットチップを配置することによって、上清を取り除きます。ホワイトペレットを乱すことなく、可能な限り、特に赤血球の破片上清をできるだけ取り除く。
- 上下にピペッティングして流れの緩衝液1ml（1X PBS、1％BSA [ウシ血清アルブミン]、2％PFA）でサンプルを再懸濁します。 1.5mlのエッペンドルフチューブにサンプルを移す。
- 室温で4 × gで5分間遠採取されたサンプルを。上清を除去する前と同じ精度を使用してください。
- ボルテックスで流れの緩衝液1mlでサンプルを再懸濁します。
フローサイトメトリー分析用2.5準備
- フローサイトメトリーを用いたサンプルの分析のために、フローサイトメトリーチューブにサンプルの100μlを加える。
- 試料100μlに指定された抗体を（正しい濃度を確保する）を追加。
- サンプルは40℃で30分間インキュベートすることができます
- フローサイトメトリーの前に流れの緩衝液で2回洗浄する。洗浄工程は、フローバッファを250μlを加えるボルテックス、350 xgで5分間遠心分離し、フローサイトメトリーチューブの一つの流体の回転と上清除去を含みます。
- フローバッファ250μlのでペレットを再懸濁します。サンプルは、フローサイトメトリーによって分析の準備ができています。
代表的な結果
全血は、赤血球と豊か循環有核細胞（のCNC）からなくし、マイクロ流体の溶解装置と後処理のプロトコルを介して実行されています。理想的な結果は、独立したCNCの人口を持つクリーンなフローサイトメトリーの散布図が得られます。図2と図3の下に表示さ溶血することなく、前方散乱光（FSC）対側方散乱（SSC）の光のような軸を持つマイクロ流体プロトコルによる溶血による全血サンプルの散布図の比較です。それは、マイクロ流体濃縮プロトコルがクリーンフローサイトメトリーの散布図を得るために必要であることが分かる。
図2。FSCとSSCの軸を持つ赤血球溶解せずに全血サンプルのフローサイトメトリーの散布図。
図3。FSCとSSCの軸を持つ集団で標識されたマイクロ流体溶血と核細胞を循環のフローサイトメトリーの散布図。リージョン1（赤）は顆粒球を表すリージョン3（青）、領域2（緑）が単球を表し、リンパ球を表しており、リージョン4（紫）が特徴とされていない。
ときに必要なプロトコルのピペットによる赤血球の破片の除去も重要である。下の図4には、赤血球の破片の余剰を示す散布図である。図2のような散布図を曇らせるではありませんが、一つにはデータ分析の赤血球破片のために追加されたイベントを考慮する必要があります。
クラスタとして見られる赤血球の破片を描いた図4。フローサイトメトリー散布図、地域5（シアン）のイベントの。
特定の抗体の表現型マーカーの染色細胞はまた、特徴的な結果を生成します。リンパ球、単球、顆粒球：以下の図では3つの異なる白血球集団のための抗体の表現型の汚れです。図5は、軸CD3とCD4にプロットされたリンパ球集団を表しています。単球および顆粒球は、それぞれ、FSCに対するCD14とCD66bのような軸を持つ6〜7図に示されています。
図5。フローサイトメトリーの散布図は、CD3とCD4の軸を持つリンパ球を描いた。
図6。フローサイトメトリーの散布図は、FSCとCD14の軸と単球を描いた。
図7。フローサイトメトリーの散布図は、FSCとCD66b軸を持つ顆粒球を描いた。
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Discussion
自動化されたマイクロ流体血液溶解プロトコルが報告されている。プロトコルの中で注目に値する重要な手順は次のとおりです。セクションP.2.1で、それはサンプルが外れ成熟した内皮細胞が含まれている偽陽性として機能するように収集された最初の血液バイアルを廃棄することが重要です。また、コレクションの1時間以内に血液サンプルを実行することを確認してください。プライミングセクションP.2.2のマイクロ流体デバイスを、それは最初に泡を取り除くことが重要です。さらに、一つのプロトコルを通して針に新しい注射器を取り付ける際に気泡を導入することは避けてください。セクションP.2.4の血1 mlシリンジに充填する際、一つは2つの溶液の混合を避けるために注射器を垂直に保ちながら、すべての、最初の1X PBSと血を忘れずに追加する必要があります。血液サンプルを押すシリンジポンプを開始する前に、システムがフルスピードになるように大規模なシリンジポンプが稼動していることを確認してください。サンプルは、デバイスを介して実行が完了し、遠心分離された後、慎重に白いペレットが剥がれないように、赤血球の破片を含めて、上清をできるだけ取り除く。最後に、セクションP.2.5で抗体の適切な濃度を確保するために、製造元のプロトコールに従って、100μLのサンプルに追加されます。
マイクロ流体プロトコルのアプリケーションでは、臨床研究に計り知れないです。 CNCの面で個々の免疫状態を問い合わせることは健康の状態に関する重要な情報を生成し、疾患の病因の診断と理解した上で役立つことがあります。血液サンプルのコレクションによって、このCNC集団にアクセスすると、腫瘍組織を含む人間の発現解析よりも簡単で便利です。循環ではこれらの有核細胞を調べるために一つは赤血球、報告されたデバイスの主要機能を含む他の血液成分、から人口を豊かにすることができなければなりません。したがって、このような研究は、マイクロ流体血液溶解プロトコルから大いに恩恵を受けるだろう。
マイクロ流体プロトコルの重要性は、アプリケーションの面で出現する。有核細胞の濃縮は、血液の臨床試験で必要とされているので、少し専門知識と明確かつ一貫性のある結果を生成するユーザが介在するステップを必要とするプロトコルが重要です。マイクロ流体のプロトコルは、自動化し、過酷な環境への細胞の制御された曝露を通して一貫性を保証します。臨床検査室間での均一性を持つデータは、[2]直接比較されます。
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Acknowledgments
研究は、トランスレーショナルリサーチのウォレス時間コールター財団早いキャリア賞によってサポートされています。血液サンプルの収集とヘルプのためのティムアンドリュース、小児血液/腫瘍学、のおかげ。また博士はサムヴェルハウゼン、フローサイトメトリーコア、フローサイトメトリーのサンプルを実行するとヘルプのためのジェームズグラハムブラウンがんセンター、おかげで。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | ||
| 30-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon tubing (.010" ID) | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000) | Harvard Apparatus | 702000 | |
| Syringe Pump (Harvard Pico Plus) | Harvard Apparatus | 702213 | |
| Flow cytometry tubes | DB Biosciences | 352052 | |
| Antibody stains | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | ||
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | ||
| 30 ml tube | Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
References
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
