Overview
Denne video beskriver teknikken til at levere forbindelser ind i hjertet af voksne zebrafisk ved hjælp af intrathoracic injektion.
Protocol
1. Forberedelse af fisken til intrahoracic injektion
- Fang en voksen zebrafisk (Danio rerio) med et net og overfør den til bedøvelsesopløsningen.
- Efter 1−2 min, når fisk holder op med at svømme og bevægelsen af operculum reduceres, skal du røre fisken med en plastske for at sikre, at den ikke reagerer på nogen kontakt.
- Overfør hurtigt og forsigtigt fisken med skeen i rillen af den våde svamp, med ventral side op. Fiskens hoved skal pege væk fra operatørens dominerende hånd.
2. Mikroinjection i Pericardium
- Under stereomikroskopet skal du omhyggeligt observere bevægelsen af det bankende hjerte under fiskens hud. Visuelt bestemme injektionspunktet over det bankende hjerte og i midten af trekanten defineret af de ventrale bruskplader (Figur 1D). Spidsen af kapillæren indsættes i en vinkel på 30−45° i forhold til kropsaksen (figur 1E). Træd forsigtigt ind i huden med spidsen af mikrokapillæren ind i pericardium (Figur 1C). Et optimalt indgangspunkt er tættere på maven end på hovedet.
BEMÆRK: Sæt ikke kapillæren for dybt ind i kroppen og hjertet, da dette vil forårsage skade på organet. I tilfælde af hjerte punktering, nålen generelt fyldes med blod. Hvis dette sker, skal du fjerne kapillæren og udelukke fisken fra forsøget. - Når nålen er inde i pericardium, komplet injektion ved at trykke på pedalen af mikroinjektor enhed.
BEMÆRK: Pas på ikke at indsprøjte luft i brysthulen. - Efter injektionen skal du forsigtigt trække kapillæren ud af brystkassen og straks overføre fisken til en tank med systemvand til genopretning.
- Overvåg fisken, indtil den er helt genoprettet fra anæstesi.
- Saml hjertet på det ønskede tidspunkt og forberede det til yderligere analyse.
BEMÆRK: Hvis fisken ikke genoptager operculumets bevægelse inden for 30 s, skal du genoplive fisken ved at klemme vand ind i gællerne med en plastpipette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: Intrathoracic (IT) injektion i voksne zebrafisk. (A) Fotografi af en trukket mikroinjection kapillær med glødetråd (6", 1,0 mm i diameter) og værdier af nålen puller program, der anvendes. (B) Fotografi af en trukket mikroinjection kapillar med glødetråd (6", 1,0 mm i diameter) fyldt med 2,5 μL opløsning indeholdende 10% phenolrød. Nålens trukket spids er maksimalt 7 mm lang. (C) Skematisk repræsentation af it-injektionsproceduren. (D) Fotografier af it-injektionsproceduren. Dette tal er blevet ændret fra Bise et al. Tal i panelerne C og D svarer til de samme trin i proceduren: (1) fisk placeres ventral side op på en befugtet svamp. Punkteringsstedet (rød prik i trekanten) er placeret i midten af brystet nær gællerne. (2) Nålens indtrængning i pericardiummet. Rød prik angiver punkteringssted. (3) Injektionen overvåges ved at observere spredningen af den røde opløsning i perikardialhulen. (E) Ordning for it-injektion. Vinklen mellem injektionskapillæren og kropsaksen skal være mellem 30° og 45° for at undgå hjerte punktering. (F) Fotografier af fisketreax 1 time efter it-injektion af angivne mængder. Hvide pile peger på det rødlige væv, hvilket kan indikere indre blødninger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
