Overview
Este vídeo descreve a técnica de entregar compostos no coração de zebrafish adulto usando injeção intratorácica.
Protocol
1. Preparação do Peixe para Injeção Intratorácica
- Pegue um zebrafish adulto (Danio rerio) com uma rede e transfira-o para a solução anestéstica.
- Depois de 1-2 min, quando o peixe parar de nadar e o movimento do operculum é reduzido, toque o peixe com uma colher de plástico para garantir que ele não reaja a nenhum contato.
- Transfira o peixe com a colher para o sulco da esponja molhada, com o lado ventral para cima. A cabeça do peixe deve apontar para longe da mão dominante do operador.
2. Microinjeção no Pericardium
- Sob o estereótipo, observe cuidadosamente o movimento do coração batendo sob a pele do peixe. Determine visualmente o ponto de injeção acima do coração pulsante e no meio do triângulo definido pelas placas cartilaginosas ventral (Figura 1D). Insira a ponta do capilar em ângulo de 30-45° em relação ao eixo da carroceria (Figura 1E). Penetre suavemente a pele com a ponta do microcapilário no pericárdio (Figura 1C). Um ponto de entrada ideal é mais perto do abdômen do que da cabeça.
NOTA: Não insira o capilar muito profundamente no corpo e no coração, pois isso causará lesões no órgão. Em caso de punção cardíaca, a agulha geralmente se enche de sangue. Se isso acontecer, remova o capilar e exclua o peixe do experimento. - Uma vez que a agulha esteja dentro do pericárdio, complete a injeção pressionando o pedal do dispositivo microinjetor.
NOTA: Tenha cuidado para não injetar ar na cavidade torácica. - Após a injeção, retire suavemente o capilar do tórax e transfira imediatamente o peixe para um tanque com água do sistema para recuperação.
- Monitore os peixes até a recuperação total da anestesia.
- Colete o coração no ponto de tempo desejado e prepare-o para uma análise mais aprofundada.
NOTA: Caso o peixe não retome o movimento do operculum dentro dos 30 s, reanime o peixe espremendo água nas brânquias com uma pipeta plástica.
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Representative Results
Figura 1: Injeção intratorácica (TI) em zebrafish adulto. (A) Fotografia de um capilar de microinjeção puxado com filamento (6", 1,0 mm de diâmetro) e valores do programa de puxador de agulhas utilizados. (B) Fotografia de uma capilarização de microinjeção puxada com filamento (6", 1,0 mm de diâmetro) preenchida com 2,5 μL de solução contendo 10% de fenol vermelho. A ponta puxada da agulha tem máxima de 7 mm de comprimento. (C) Representação esquemática do procedimento de injeção de TI. (D) Fotografias do procedimento de injeção de TI. Este valor foi modificado de Bise et al. Os números dos painéis C e D correspondem aos mesmos passos do procedimento: (1) o peixe é colocado do lado ventral em uma esponja umidificada. O local da punção (ponto vermelho no triângulo) está localizado no centro do peito perto das brânquias. (2) Penetração da agulha no pericárdio. Ponto vermelho indica local de perfuração. (3) A injeção é monitorada observando a disseminação da solução vermelha na cavidade pericárida. (E) Esquema de injeção de TI. O ângulo entre a injeção capilar e o eixo corporal deve estar entre 30° e 45° para evitar punção cardíaca. (F) Fotografias do tórax de peixe a 1 hora após a injeção de TI dos volumes indicados. Setas brancas estão apontando para o tecido avermelhado, o que pode indicar hemorragia interna
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
