Overview
Este video describe la técnica de entregar compuestos en el corazón del pez cebra adulto mediante el uso de inyección intratorácica.
Protocol
1. Preparación del pescado para inyección intratorácica
- Captura un pez cebra adulto(Danio rerio)con una red y transfiéralo a la solución anestésica.
- Después de 1-2 min, cuando el pescado deje de nadar y se reduzca el movimiento del operculum, toque el pescado con una cuchara de plástico para asegurarse de que no reacciona a ningún contacto.
- Transfiera rápida y cuidadosamente el pescado con la cuchara a la ranura de la esponja húmeda, con el lado ventral hacia arriba. La cabeza del pez debe apuntar lejos de la mano dominante del operador.
2. Microinjeción en el Pericardio
- Bajo el estereomicroscopio, observe cuidadosamente el movimiento del corazón palpitante debajo de la piel del pez. Determine visualmente el punto de inyección por encima del corazón palpitante y en el centro del triángulo definido por las placas cartilaginosas ventrales (Figura 1D). Inserte la punta del capilar en ángulo de 30-45° grados en relación con el eje del cuerpo (Figura 1E). Penetrar suavemente la piel con la punta del microcapilar en el pericardio (Figura 1C). Un punto de entrada óptimo está más cerca del abdomen que de la cabeza.
NOTA: No inserte el capilar demasiado profundamente en el cuerpo y el corazón, ya que esto causará lesiones en el órgano. En caso de pinchazo cardíaco, la aguja generalmente se llena de sangre. Si esto sucede, retire el capilar y excluya a los peces del experimento. - Una vez que la aguja está dentro del pericardio, complete la inyección presionando el pedal del dispositivo microinyector.
NOTA: Tenga cuidado de no inyectar aire en la cavidad torácica. - Después de la inyección, retire suavemente el capilar del tórax y transfiera inmediatamente el pescado a un tanque con agua del sistema para su recuperación.
- Monitoree los peces hasta la recuperación total de la anestesia.
- Recoger el corazón en el punto de tiempo deseado y prepararlo para su posterior análisis.
NOTA: En caso de que el pez no reanude el movimiento del operculum en un radio de 30 s, reanimar a los peces exprimiendo el agua en las branquias con una pipeta de plástico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 1: Inyección intratorácica (TI) en peces cebra adultos. (A) Fotografía de un capilar de microinjección tirado con filamento (6", 1,0 mm de diámetro) y los valores del programa de extracción de agujas utilizados. (B) Fotografía de un capilar de microinjección tirado con filamento (6", 1,0 mm de diámetro) lleno de 2,5 μL de solución que contiene un 10% de fenol rojo. La punta tirada de la aguja mide al máximo 7 mm de largo. (C) Representación esquemática del procedimiento de inyección de TI. (D) Fotografías del procedimiento de inyección de TI. Esta cifra ha sido modificada de Bise et al. Los números en los paneles C y D corresponden a los mismos pasos del procedimiento: (1) el pescado se coloca lado ventral hacia arriba en una esponja humidificada. El sitio de punción (punto rojo en el triángulo) se encuentra en el centro del pecho cerca de las branquias. (2) Penetración de la aguja en el pericardio. El punto rojo indica el sitio de punción. (3) La inyección se controla observando la propagación de la solución roja en la cavidad pericardial. (E) Esquema de inyección de TI. El ángulo entre el capilar de inyección y el eje del cuerpo debe estar entre 30° y 45° para evitar la punción cardíaca. (F) Fotografías del tórax de pez a la 1 hora después de la inyección de TI de los volúmenes indicados. Las flechas blancas apuntan al tejido rojizo, lo que podría indicar sangrado interno
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
