प्राथमिक मैमोस्फीयर का उत्पादन: सेल शक्ति निर्धारित करने के लिए एक तकनीक

Overview

इस वीडियो स्तन कैंसर सेल लाइनों से कैंसर स्टेम कोशिकाओं को अलग करने का वर्णन करता है । हम इन कैंसर स्टेम सेल को आत्म-नवीकरण का आकलन करने और क्षेत्र बनाने की दक्षता की गणना करने के लिए प्राथमिक मैमोसेयर उत्पन्न करने के लिए संस्कृति करते हैं, जिससे विभिन्न बीज घनत्वों में तुलना की अनुमति मिलती है।

Protocol

1. मानव स्तन कैंसर सेल लाइनों से प्राथमिक स्तन रोगों की पीढ़ी

नोट: एक बाँझ संस्कृति हुड के तहत निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें।

1. 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, 100 यू/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम/एफ12 युक्त मैमोस्फीयर मीडिया तैयार करें। 20 एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) जोड़कर उपयोग से पहले तुरंत पूरा मीडिया तैयार करें; सिग्मा), 10 एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (टीएफजीएफ; आर एंड डी सिस्टम) और 1x B27 पूरक।
2. फ्लास्क युक्त फ्लास्क से मीडिया जिसमें अनुयायी एमसीएफ-7 या एमडीए-एमबी-231 कोशिकाएं (या आपकी पसंद की स्तन कैंसर सेल लाइन; 70-80% संगम), 1x पीबीएस में दो बार धोएं, और कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें।
3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। 1-5 मिलीलीटर मैमोस्फीयर मीडिया में डेजेंट सुपरनेट और रिसिपेंड कोशिकाएं। पिपेट ऊपर और नीचे और यदि आवश्यक हो तो एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 40 माइक्रोन सेल छन्नी टोपी फिल्टर का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें कि एक सेल निलंबन का गठन किया गया है (यदि नहीं, तो सेल निलंबन को 3 बार तक सिरिंज करने के लिए 25 जी सुई का उपयोग करें)।
4. यदि आवश्यक हो तो CD44+ CD24-सेलुलर सबसेट को एंटी-सीडी24-फाइकोरीथ्रिन (पीई) और एंटी-सीडी 44-फ्लोरोसाइनिन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी⁹का उपयोग करके FACS के माध्यम से अलग करें। वैकल्पिक रूप से, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एंटी-सीडी 44 और एंटी-सीडी 24-बायोटिन संयुक्त माइक्रोमोतियों के साथ चुंबकीय-सक्रिय सेल छंटाई (एमएएक्स) प्रणाली का उपयोग करके ऐसी आबादी को अलग करें। एलएस कॉलम का उपयोग करके सकारात्मक चयन करें, और एलडी कॉलम का उपयोग करके नकारात्मक चयन करें और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सभी अलग कोशिकाओं के फेनोटाइप की पुष्टि करें।
5. ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके प्रति मिलीलीटर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
   नोट: कोशिका व्यवहार्यता की गणना हीमोसाइटोमीटर पर ग्रिड के भीतर कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के रूप में की जाती है। ट्राइपैन ब्लू लेने वाली कोशिकाओं को गैर-व्यवहार्य माना जाता है। निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं के अनुपात को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
   1. पीबीएस में ट्राइपैन ब्लू का 0.4% समाधान तैयार करें। 1 मिलीलीटर कोशिकाओं में 0.1 मिलीलीटर ट्राइपैन ब्लू स्टॉक समाधान जोड़ें। एक हीमोसाइटोमीटर लोड करें और कम आवर्धन पर एक माइक्रोस्कोप के नीचे तुरंत जांच करें। कुल कोशिकाओं की संख्या और नीले धुंधला कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। व्यवहार्य कोशिकाएं = [1.00 - (नीली कोशिकाओं की संख्या ÷ कुल कोशिकाओं की संख्या)] 100 ×।
   2. संस्कृति के प्रति मिलीलीटर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए, नीचे दिए गए सूत्र का उपयोग करें। कमजोर पड़ने के कारक के लिए सही करने के लिए याद रखें।
      व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या 10⁴ × × 1.1 = कोशिकाओं/
6. एक 6-अच्छी तरह से अल्ट्रा-कम अनुयायी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 2 मिलीलीटर पूर्ण मैमोस्फीयर मीडिया में कोशिकाओं की पूर्व निर्धारित मात्रा को फिर से खर्च करें। सीडिंग घनत्व सामान्य रूप से 500-4000 कोशिकाओं/सेमी 2 सेल प्रति अच्छी^तरह से होता है । वैकल्पिक रूप से कम लगाव 24 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करते हुए मीडिया के ०.५ मिलीलीटर में एक ही घनत्व पर कोशिकाओं बोने ।
   नोट: हम ब्याज की प्रत्येक सेल लाइनों के लिए सीडिंग घनत्व और संस्कृति के समय के अनुकूलन की सलाह देते हैं।
7. प्लेटों को परेशान किए बिना, विशेष रूप से पहले 5 दिनों के विकास चरण के दौरान, 5-10 दिनों (सेल लाइन और मैमोस्फीयर के आकार के आधार पर) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रा कम-अटैचमेंट 6-वेल प्लेटें और 5% सीओ₂ 5-10 दिनों के लिए (सेल लाइन और मैमोस्फीयर के आकार के आधार पर) ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814