Birincil Mammosferlerin Üretimi: Hücre Gücünü Belirleme Tekniği

Overview

Bu videoda meme kanseri hücre çizgilerinden kanser kök hücrelerinin izole edilmesi anlatılıyor. Bu kanser kök hücrelerini, farklı tohumlama yoğunluklarında karşılaştırmaya izin vererek, kendini yenilemeyi değerlendirmek ve küre oluşturan verimliliği hesaplamak için birincil mammosferler üretmek için kültürlüyoruz.

Protocol

1. İnsan Meme Kanseri Hücre Hatlarından Birincil Mammosfer Üretimi

NOT: Steril bir kültür başlığı altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

1. 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin, 100 U/ml streptomisidin ile desteklenmiş DMEM/F12 içeren Mammosphere Media hazırlayın. 20 ng/ml rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinant insan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF; Ar-Ge Sistemleri) ve 1x B27 takviyesi.
2. Uyumlu MCF-7 veya MDA-MB-231 hücreleri (veya seçtiğiniz bir meme kanseri hücre hattı; % 70-80 izdiham) içeren şişeden medyayı aspire edin, 1x PBS'de iki kez yıkayın ve hücreleri trypsinize edin.
3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 200 x g'da santrifüj hücreleri. 1-5 ml mammosfer ortamlarında dekant süpernatant ve resuspend hücreler. Pipet yukarı ve aşağı ve gerekirse tek hücreli süspansiyon elde etmek için 40 μm hücre süzgeç kapağı filtresi kullanın. Tek bir hücre süspansiyonu oluştuğundan emin olmak için bir hemositometre kullanın (değilse, hücre süspansiyonu 3 kata kadar şırıngalamak için 25 G'lık bir iğne kullanın).
4. Gerekirse ANTI-CD24-phycoerythrin (PE) ve anti-CD44-floresan izotiyosiyanat (FITC) monoklonal antikorları kullanarak FACS aracılığıyla CD44 +CD24- hücresel alt kümesi izole^{edin 9}. Alternatif olarak, üreticinin talimatlarına göre anti-CD44 ve anti-CD24-biotin kombine mikrobeadları ile manyetik olarak etkinleştirilmiş bir hücre sıralama (MACS) sistemi kullanarak bu popülasyonu izole edin. LS sütunlarını kullanarak pozitif seçim ve LD sütunlarını kullanarak negatif seçim gerçekleştirin ve akış sitometrisine göre tüm yalıtılmış hücrelerin fenotiplerini onaylayın.
5. Trypan mavisi kullanarak ml başına uygulanabilir hücre sayısını hesaplayın.
   NOT: Hücre canlılığı, hemositometredeki ızgaralardaki toplam hücre sayısına bölünen canlı hücre sayısı olarak hesaplanır. Trippan mavisi alan hücreler uygun değil olarak kabul edilir. Aşağıdaki prosedür, canlı hücrelerin oranını doğru bir şekilde belirlemek için kullanılır.
   1. PBS'de %0,4'lük bir trippan mavisi çözeltisi hazırlayın. 1 ml hücreye 0,1 ml trypan mavi stok çözeltisi ekleyin. Bir hemositometre yükleyin ve düşük büyütmede mikroskop altında hemen inceleyin. Toplam hücre sayısını ve mavi boyama hücrelerinin sayısını sayın. Uygulanabilir hücreler = [1.00 – (Mavi hücre sayısı ÷ Toplam hücre sayısı)] × 100.
   2. Kültür ml başına uygulanabilir hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın. Seyreltme faktörü için düzeltmeyi unutmayın.
      10⁴ × 1,1 = hücre/ml kültürü × uygulanabilir hücre sayısı
6. 6 kuyulu ultra düşük yapışan plakanın her kuyusunda 2 ml tam mammosfer ortamında önceden belirlenmiş miktarda hücreyi yeniden biriktirin. Tohumlama yoğunluğu normalde kuyu başına 500-4.000 hücre/cm² hücredir. İsteğe bağlı olarak, hücreleri 0,5 ml ortamda aynı yoğunlukta tohumlarken düşük ekli 24 kuyu plakaları kullanın.
   NOT: Her hücre hattı için tohumlama yoğunluğunun ve kültür zamanının optimize edilmesi öneririz.
7. Özellikle ilk 5 günün büyüme aşamasında plakaları bozmadan 5-10 gün boyunca (hücre hattına ve mammosferlerin büyüklüğüne bağlı olarak) 37 °C'de ultra düşük ekli 6 kuyu plakalarını ve %5 CO_2'yi kuluçkaya yatırın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814