Generation af primære mammosfærer: En teknik til at bestemme cellestyrken

Overview

Denne video beskriver isolere kræft stamceller fra brystkræft cellelinjer. Vi dyrker disse kræftstamceller til at generere primære mammosfærer til vurdering af selvfornyelse og beregning af sfæredannende effektivitet, hvilket gør det muligt at sammenligne på tværs af forskellige såningstætheder.

Protocol

1. Generation af primære mammosfærer fra Human Breast Cancer Cell Lines

BEMÆRK: Udfør følgende trin under en steril hætte.

1. Forbered Mammosphere Media, der indeholder DMEM/F12 suppleret med 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin. Forbered komplette medier umiddelbart før brug ved at tilføje 20 ng/ml rekombinant human epidermal vækstfaktor (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinant human basic fibroblast vækstfaktor (bFGF; F&U-systemer) og 1x B27-tillæg.
2. Aspirat medier fra kolbe, der indeholder vedhængende MCF-7 eller MDA-MB-231 celler (eller en brystkræft celle linje efter eget valg; 70-80% sammenløb), vask to gange i 1x PBS, og trypsinize celler.
3. Centrifuge celler ved 200 x g ved stuetemperatur i 5 min. Dekantere supernatanter og genanvendelige celler i 1-5 ml mammosfæremedier. Pipette op og ned og om nødvendigt bruge en 40 μm celle si cap filter for at opnå enkelt-celle suspension. Brug et hæmometer for at sikre, at der er dannet en enkelt celleaffjedring (hvis ikke, skal du bruge en 25 G-nål til at sprøjte celleaffjedringen op til 3 gange).
4. Om nødvendigt isolere CD44+CD24- cellulær delmængde via FACS ved hjælp af anti-CD24-phycoerythrin (PE) og anti-CD44-fluorescein isothiocyanat (FITC) monoklonale antistoffer⁹. Alternativt kan du isolere en sådan population ved hjælp af et MACS-system (Magnetic-Activated Cell Sorting) med anti-CD44 og anti-CD24-biotin kombinerede mikroperler i henhold til producentens anvisninger. Udfør positiv markering ved hjælp af LS-kolonner og negativ markering ved hjælp af LD-kolonner, og bekræft fænotyperne for alle isolerede celler efter flowcytometry.
5. Beregn antallet af levedygtige celler pr. ml ved hjælp af trypanblå.
   BEMÆRK: Celle levedygtighed beregnes som antallet af levedygtige celler divideret med det samlede antal celler i gitrene på hæmometeret. Celler, der optager trypan blå betragtes som ikke-levedygtige. Følgende procedure bruges til præcist at bestemme andelen af levedygtige celler.
   1. Forbered en 0,4% opløsning af trypan blå i PBS. Der tilsættes 0,1 ml trypanblå stamopløsning til 1 ml celler. Lad et hæmocytometer og undersøg straks under et mikroskop ved lav forstørrelse. Tæl antallet af totalceller og antallet af blå farvningsceller. Levedygtige celler = [1,00 – (Antal blå celler ÷ antal samlede celler)] × 100.
   2. Hvis du vil beregne antallet af levedygtige celler pr. ml kultur, skal du bruge formlen nedenfor. Husk at korrigere for fortyndingsfaktoren.
      Antal levedygtige celler × 10⁴ × 1,1 = celler/ml dyrkning
6. Resuspend en forudbestemt mængde celler i 2 ml komplet mammosphere medier i hver brønd af en 6-godt ultra-lav klæbende plade. Såningstætheden er normalt 500-4.000 celler/cm² celle pr. brønd. Brug eventuelt lav fastgørelse 24-brønds plader, mens såning celler på samme tæthed i 0,5 ml medier.
   BEMÆRK: Vi anbefaler optimering af såning tæthed og tid af kultur for hver celle linjer af interesse.
7. Der inkuberes ultralave 6-brøndsplader ved 37 °C og 5% CO₂ i 5-10 dage (afhængigt af cellelinjen og mammosfærernes størrelse) uden at forstyrre pladerne, især i vækstfasen af de første 5 dage.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814