Génération de mammosphères primaires : une technique pour déterminer la puissance cellulaire

Overview

Cette vidéo décrit l’isolement des cellules souches cancéreuses des lignées de cellules cancéreuses du sein. Nous avons cultivé ces cellules souches cancéreuses pour générer des mammosphères primaires pour évaluer l’auto-renouvellement et calculer l’efficacité de formation de sphère, permettant la comparaison entre différentes densités d’ensemencement.

Protocol

1. Génération de mammosphères primaires à partir de lignées cellulaires du cancer du sein humain

REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes sous un capot de culture stérile.

1. Préparer Mammosphere Media contenant du DMEM/F12 complété par 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline, 100 U/ml de streptomycine. Préparer les supports complets immédiatement avant l’utilisation en ajoutant 20 ng/ml de facteur de croissance épidermique humain recombinant (FEM; Sigma), 10 ng/ml de facteur de croissance fibroblaste de base humain recombinant (bFGF; R & D Systems) et 1x B27 supplément.
2. Aspirez les médias des flacons contenant des cellules MCF-7 ou MDA-MB-231 adhérentes (ou une lignée de cellules cancéreuses du sein de votre choix; confluence de 70-80%), lavez-les deux fois en 1x PBS, et trypsinize cellules.
3. Cellules centrifugeuses à 200 x g à température ambiante pendant 5 min. Cellules supernatantes et résuspendantes décantées dans 1-5 ml de médias de mammosphère. Pipette de haut en bas et si nécessaire utiliser un filtre de bouchon de passoire cellulaire de 40 μm pour obtenir une suspension à cellule unique. Utilisez un hémocytomètre pour vous assurer qu’une seule suspension cellulaire s’est formée (sinon, utilisez une aiguille de 25 G pour seringuer la suspension cellulaire jusqu’à 3 fois).
4. Si nécessaire isoler CD44+CD24- sous-ensemble cellulaire via FACS en utilisant anticorps monoclonaux anti-CD24-phycoerythrine (PE) et anti-CD44-fluorescéine isothiocyanate (FITC) anticorps monoclonaux⁹. Alternativement, isoler cette population à l’aide d’un système de tri cellulaire à activation magnétique (MACS) avec des microbilles combinées anti-CD44 et anti-CD24-biotine selon les instructions du fabricant. Effectuez une sélection positive à l’aide de colonnes LS, et une sélection négative à l’aide de colonnes LD et confirmez les phénotypes de toutes les cellules isolées par cytométrie d’écoulement.
5. Calculer le nombre de cellules viables par ml à l’aide de trypan bleu.
   REMARQUE: La viabilité cellulaire est calculée comme le nombre de cellules viables divisées par le nombre total de cellules dans les grilles de l’hémocytomètre. Les cellules qui prennent le bleu trypan sont considérées comme non viables. La procédure suivante est utilisée pour déterminer avec précision la proportion de cellules viables.
   1. Préparez une solution de 0,4% de bleu trypan en PBS. Ajouter 0,1 ml de solution de bouillon bleu trypan à 1 ml de cellules. Chargez un hemocytomètre et examinez immédiatement au microscope à faible grossissement. Comptez le nombre total de cellules et le nombre de cellules colorantes bleues. Cellules viables = [1,00 – (Nombre de cellules bleues ÷ nombre total de cellules)] × 100.
   2. Pour calculer le nombre de cellules viables par ml de culture, utilisez la formule ci-dessous. N’oubliez pas de corriger le facteur de dilution.
      Nombre de cellules viables × 10⁴ × 1,1 = culture cellules/ml
6. Resuspendez une quantité prédéterminée de cellules dans 2 ml de médias mammosphère complets dans chaque puits d’une plaque d’adhérent ultra-faible de 6 puits. La densité d’ensemencement est normalement de 500 à 4 000 cellules/cm² par puits. Utilisez en option de faibles plaques de fixation de 24 puits tout en ensemencement des cellules à la même densité dans 0,5 ml de médias.
   REMARQUE: Nous recommandons l’optimisation de la densité d’ensemencement et du temps de culture pour chaque lignée cellulaire d’intérêt.
7. Incuber des plaques ultra-à faible fixation de 6 puits à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 5 à 10 jours (selon la lignée cellulaire et la taille des mammosphères) sans perturber les plaques, en particulier pendant la phase de croissance des 5 premiers jours.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814