הדור של ממוספרות ראשיות: טכניקה כדי לקבוע את עוצמת התא

Overview

וידאו זה מתאר בידוד תאי גזע סרטניים מקווי תאים סרטניים בשד. אנו תרבות אלה תאי גזע סרטניים כדי ליצור ממוגרפיה ראשונית להערכת התחדשות עצמית וחישוב יעילות יצירת כדור, המאפשר השוואה על פני צפיפויות זריעה שונות.

Protocol

1. דור הממוספרות העיקריות מקווי התאים של סרטן השד האנושי

שים לב: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסה המנוע של התרבות הסטרילית.

1. הכן מדיה ממוספרית המכילה DMEM/F12 בתוספת 2 מ"מ ל-גלוטמין, 100 U/ml פניצילין, 100 U/ml סטרפטומיצין. הכן מדיה מלאה מיד לפני השימוש על ידי הוספת 20 ננוגרם / מיליליטר גורם גדילה אפידרמיס אנושי רקומביננטי (EGF; סיגמא), 10 ng/ml גורם גדילה פיברובלסט אנושי בסיסי (bFGF; מערכות R&D) ותוסף 1x B27.
2. שאפתן מדיה מבקבוק המכיל תאים MCF-7 חסידים או MDA-MB-231 (או קו תאים סרטני השד על פי בחירתך; 70-80% מפגש), לשטוף פעמיים 1x PBS, ולנסות תאים.
3. תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. פענוח תאים על טבעיים ו resuspend ב 1-5 מ"ל של מדיה mammosphere. פיפטה למעלה ולמטה ובמידת הצורך להשתמש מסנן 40 תא מסננת תאים כדי להשיג השעיה של תא יחיד. השתמש hemocytometer כדי להבטיח השעיה תא יחיד נוצר (אם לא, להשתמש במחט 25 G כדי מזרק השעיית התא עד 3 פעמים).
4. במידת הצורך לבודד CD44 +CD24- קבוצת משנה הסלולר באמצעות FACS באמצעות נוגדנים חד שבטיים נגד CD24-phycoerythrin (PE) ואנטי CD44-פלואורסצנטיים isothiocyanate (FITC) נוגדנים חד שבטיים⁹. לחלופין, לבודד אוכלוסייה כזו באמצעות מערכת מיון תאים המופעלת מגנטית (MACS) עם אנטי CD44 ואנטי CD24-ביוטין משולב microbeads לפי הוראות היצרן. בצע בחירה חיובית באמצעות עמודות LS ובחירה שלילית באמצעות עמודות LD ואשר את הפנוטיפים של כל התאים המבודדים לפי ציטומטריית זרימה.
5. חשב את מספר התאים בני קיימא לכל מ"ל באמצעות כחול trypan.
   שים לב: הכדאיות של התא מחושבת כמספר התאים בני קיימא חלקי המספר הכולל של תאים בתוך הרשתות על המוציטרומטר. תאים שתועלים כחול טריפאן נחשבים בלתי קיימא. ההליך הבא משמש כדי לקבוע במדויק את חלקם של תאים בני קיימא.
   1. הכינו פתרון של 0.4% לכחול טריפאן ב-PBS. הוסף 0.1 מ"ל של פתרון מלאי כחול trypan ל 1 מ"ל של תאים. לטעון hemocytometer ולבחון מיד תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. ספור את מספר התאים הכולל ואת מספר התאים הכתמים הכחולים. תאים בני קיימא = [1.00 – (מספר התאים הכחולים ÷ מספר התאים הכולל)] × 100.
   2. כדי לחשב את מספר התאים בני קיימא לכל מ"ל של תרבות, השתמש בנוסחה שלהלן. זכור לתקן את גורם הדילול.
      מספר תאים בני קיימא × 10⁴ × 1.1 = תאים / מיליליטר תרבות
6. Resuspend כמות שנקבעה מראש של תאים 2 מ"ל של מדיה mammosphere מלאה בכל באר של צלחת 6-well אולטרה נמוך חסידים. צפיפות הזריעה היא בדרך כלל 500-4,000 תאים / ס"מ² תאים לבאר. לחלופין, השתמש בלוחות 24 בארות בחיבור נמוך תוך זריעת תאים באותה צפיפות ב- 0.5 מ"ל של מדיה.
   שים לב: אנו ממליצים על אופטימיזציה של צפיפות הזריעה וזמן התרבות עבור כל קווי תאים מעניינים.
7. דגירה אולטרה חיבור נמוך 6-באר צלחות ב 37 °C ו 5% CO₂ במשך 5-10 ימים (בהתאם לקו התא ואת הגודל של ממוספרות) מבלי להפריע הצלחות, במיוחד בשלב הצמיחה של 5 הימים הראשונים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814