Overview
このビデオでは、乳癌細胞株から癌幹細胞を単離する方法について説明します。これらのがん幹細胞を培養して、自己再生を評価し、球形成効率を計算するための原発性のmmmosphereを生成し、異なる播種密度間での比較を可能にする。
Protocol
ヒト乳癌細胞株からの原発マンモスフィアの生成
注: 滅菌培養フードの下で次の手順を実行します。
- 2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100 U/mlストレプトマイシンを補充したDMEM/F12を含むMammosphere培地を準備します。20 ng/ml組み換えヒト表皮成長因子(EGF;シグマ、10 ng/ml組換えヒト基本線維芽細胞増殖因子(bFGF;研究開発システム)および1x B27サプリメント。
- 付着性MCF-7またはMDA-MB-231細胞(または好みの乳癌細胞株;70-80%合流)を含むフラスコからの吸引培地、1x PBSで2回洗浄し、細胞をトリプシン化する。
- 遠心分離細胞を室温で200xgで5分間用いた。1〜5 mlのmmmosphere培地中のデカント上清および再懸濁細胞。ピペットは上下し、必要に応じて40 μmのセルストレーナーキャップフィルターを使用して単一細胞懸濁液を得ます。ヘモサイトメーターを使用して、単一の細胞懸濁液が形成されていることを確認します(そうでなければ、25Gの針を使用して細胞懸濁液を3回まで注射してください)。
- 必要に応じてCD44+CD24-FACSを介して細胞サブセットを単離し、抗CD24-フィコエリスリン(PE)および抗CD44-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)モノクローナル抗体9を用いた。あるいは、製造業者の指示に従って、抗CD44および抗CD24-ビオチン結合マイクロビーズを用いた磁気活性化細胞選別(MACS)システムを用いて、このような集団を分離する。LSカラムを使用して正の選択を行い、LDカラムを使用して負の選択を行い、フローサイトメトリーによってすべての分離細胞のフェノタイプを確認します。
- トリパンブルーを使用して、ml当たりの生存細胞数を計算します。
注: 細胞生存率は、生存細胞の数を、ヘモサイトメーター上のグリッド内の細胞の総数で割った値として計算される。トリパンブルーを占めている細胞は生存不可能と見なされます。以下の手順は、生存細胞の比率を正確に決定するために使用されます。- PBSでトリパンブルーの0.4%溶液を準備します。細胞の1 mlに0.1 mlのトリパンブルーストック溶液を加えます。ヘモサイトメーターを積み込み、低倍率で顕微鏡ですぐに検査します。合計セル数と青い染色セル数をカウントします。有効なセル = [1.00 – (青いセルの数÷合計セル数)] × 100 個。
- 培養液の1ml当たりの生存細胞数を計算するには、以下の式を使用する。希釈係数を修正することを忘れないでください。
10個×1.1=細胞/ml培養×生存細胞数
- 6ウェル超低接着プレートの各ウェルに2mlの完全なマモスフィア培地で、予め決定された量の細胞を再懸濁させる。播種密度は通常、ウェルあたり500-4,000セル/cm2細胞です。必要に応じて、0.5 mlの培地で同じ密度の細胞を播種しながら、低い取り付け24ウェルプレートを使用します。
注: 対象の各細胞株について、播種密度と培養時間の最適化をお勧めします。 - 37°Cで超低く付着した6ウェルプレートを5〜10日間(細胞株とマムモスフィアの大きさに依存)でインキュベートし、特に最初の5日間の成長段階でプレートを乱します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 |
