Generasjon av primære mammospheres: En teknikk for å bestemme cellestyrke

Overview

Denne videoen beskriver isolering av kreft stamceller fra brystkreft cellelinjer. Vi dyrker disse kreftstamcellene for å generere primære mammospheres for å vurdere selvfornyelse og beregning av sfæredannende effektivitet, slik at sammenligning på tvers av forskjellige såddtettheter.

Protocol

1. Generasjon av primære mammosfærer fra humane brystkreftcellelinjer

MERK: Utfør følgende trinn under en steril kulturhette.

1. Forbered Mammosphere Media som inneholder DMEM/F12 supplert med 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin. Forbered komplette medier umiddelbart før bruk ved å legge til 20 ng/ml rekombinant human epidermal vekstfaktor (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinant human grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF; FoU-systemer) og 1x B27 supplement.
2. Aspirere medier fra kolbe som inneholder tilhenger MCF-7 eller MDA-MB-231 celler (eller en brystkreftcellelinje etter eget valg; 70-80% samløp), vask to ganger i 1x PBS og prøv celler.
3. Sentrifuger celler ved 200 x g ved romtemperatur i 5 min. Decant supernatant og resuspend celler i 1-5 ml mammosphere media. Pipette opp og ned og om nødvendig bruke et 40 μm cellesilhettefilter for å oppnå encellet suspensjon. Bruk et hemocytometer for å sikre at en enkelt celle suspensjon har dannet seg (hvis ikke, bruk en 25 G nål til å sprøyte celleopphenget opptil 3 ganger).
4. Om nødvendig isolere CD44 +CD24- cellulært delsett via FACS ved hjelp av anti-CD24-phycoerythrin (PE) og anti-CD44-fluorescein isothiocyanate (FITC) monoklonale antistoffer⁹. Alternativt kan du isolere en slik populasjon ved hjelp av et magnetisk aktivert cellesorteringssystem (MACS) med anti-CD44 og anti-CD24-biotin kombinerte mikrober i henhold til produsentens instruksjoner. Utfør positiv merking ved hjelp av LS-kolonner, og negativ merking ved hjelp av LD-kolonner og bekreft fenotypene til alle isolerte celler ved strømningscytometri.
5. Beregn antall levedyktige celler per ml ved hjelp av trypan blå.
   MERK: Celle levedyktighet beregnes som antall levedyktige celler delt på totalt antall celler i rutenettene på hemocytometeret. Celler som tar opp trypan blå anses som ikke-levedyktige. Følgende prosedyre brukes til å nøyaktig bestemme andelen levedyktige celler.
   1. Forbered en 0,4% løsning av trypan blå i PBS. Tilsett 0,1 ml trypan blå lageroppløsning til 1 ml celler. Last inn et hemocytometer og undersøk umiddelbart under et mikroskop ved lav forstørrelse. Tell antall totalceller og antall blå fargeceller. Levedyktige celler = [1,00 – (Antall blå celler ÷ Antall totalceller)] × 100.
   2. For å beregne antall levedyktige celler per ml kultur, bruk formelen nedenfor. Husk å korrigere for fortynningsfaktoren.
      Antall levedyktige celler × 10⁴ × 1,1 = celler/ml kultur
6. Resuspend en forhåndsbestemt mengde celler i 2 ml komplette mammosphere media i hver brønn av en 6-brønn ultra-lav tilhengerplate. Såddtettheten er normalt 500-4000 celler / cm² celle per brønn. Bruk eventuelt lave festeplater med 24 brønner mens du sår celler med samme tetthet i 0,5 ml medier.
   MERK: Vi anbefaler optimalisering av såingstetthet og kulturtid for hver cellelinje av interesse.
7. Inkuber ultralavt feste 6-brønnsplater ved 37 °C og 5 % CO₂ i 5–10 dager (avhengig av cellelinjen og størrelsen på mammosfærene) uten å forstyrre platene, spesielt i vekstfasen de første 5 dagene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814