Generering av primära mammosfärer: En teknik för att bestämma cellpotens

Overview

Denna video beskriver isolerande cancerstamceller från bröstcancer cellinjer. Vi odlar dessa cancerstamceller för att generera primära mammosfärer för att bedöma självförnyelse och beräkna sfärbildande effektivitet, vilket möjliggör jämförelse över olika såddtätheter.

Protocol

1. Generation av primära mammosfärer från mänskliga bröstcancer cellinjer

OBS: Utför följande steg under en steril odlingshuv.

1. Förbered Mammosphere Media innehållande DMEM/F12 kompletterat med 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin. Förbered hela mediet omedelbart före användning genom att tillsätta 20 ng/ml rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinant mänsklig grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF; FoU-system) och 1x B27 tillägg.
2. Aspirera media från kolv som innehåller vidhäftande MCF-7- eller MDA-MB-231-celler (eller en valfri bröstcancercelllinje; 70-80% sammanflöde), tvätta två gånger i 1x PBS och prova på celler.
3. Centrifugceller vid 200 x g vid rumstemperatur i 5 min. Dekanta supernatant och återanvända celler i 1-5 ml mammosfär media. Pipett upp och ner och använd vid behov ett 40 μm cellsillockfilter för att få encellig fjädring. Använd en hemocytometer för att säkerställa att en encellig suspension har bildats (om inte, använd en 25 G nål för att spruta cellupphängningen upp till 3 gånger).
4. Isolera vid behov CD44+CD24- cellulär delmängd via FACS med anti-CD24-fykoerythrin (PE) och anti-CD44-fluorescein isothiocyanate (FITC) monoklonala antikroppar⁹. Alternativt isolera en sådan population med hjälp av ett magnetiskt aktiverat cellsorteringssystem (MACS) med anti-CD44 och anti-CD24-biotin kombinerade mikrober enligt tillverkarens instruktioner. Utför positiv markering med LS-kolumner och negativ markering med hjälp av LD-kolumner och bekräfta fenotyperna för alla isolerade celler genom flödescytometri.
5. Beräkna antalet livskraftiga celler per ml med trypanblått.
   OBS: Cellens livskraft beräknas som antalet livskraftiga celler dividerat med det totala antalet celler i rutnäten på hemocytometern. Celler som tar upp trypanblått anses inte vara livskraftiga. Följande procedur används för att exakt bestämma andelen livskraftiga celler.
   1. Förbered en 0,4% lösning av trypanblått i PBS. Tillsätt 0,1 ml trypanblå stamlösning till 1 ml celler. Ladda en hemocytometer och undersök omedelbart under ett mikroskop vid låg förstoring. Räkna antalet totala celler och antalet blå färgningsceller. Livskraftiga celler = [1,00 – (Antal blå celler ÷ Antal totala celler)] × 100.
   2. Om du vill beräkna antalet livskraftiga celler per ml kultur använder du formeln nedan. Kom ihåg att korrigera för utspädningsfaktorn.
      Antal livskraftiga celler × 10⁴ × 1,1 = celler/ml-odling
6. Återanvänd en förutbestämd mängd celler i 2 ml komplett mammosfärmedier i varje brunn på en 6-brunn ultralåg vidhäftande platta. Såddtätheten är normalt 500-4 000 celler/cm² cell per brunn. Använd tillval 24-brunnsplattor med låg fastsättning medan du sår celler med samma densitet i 0,5 ml media.
   OBS: Vi rekommenderar optimering av såddtäthet och kulturtid för varje cellinjer av intresse.
7. Inkubera ultralåga 6-brunnsplattor vid 37 °C och 5 % CO₂ i 5-10 dagar (beroende på cellinjen och mammosfärens storlek) utan att störa plattorna, särskilt under tillväxtfasen under de första 5 dagarna.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814