Summary
Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrangbrüche auf der Grundlage γH2AX Brennpunkten hat sich zu einem wertvollen Werkzeug, vor allem in der Strahlenbiologie, für die Auswertung von Gewebe Strahlenempfindlichkeit und die Auswirkungen der Strahlung modifizierende Verbindungen. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Brennpunkte in Gewebeproben.
Abstract
DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind besonders tödlich und gentoxische Läsionen, die entweder entstehen können durch endogene (physiologischen oder pathologischen) Prozesse oder durch exogene Faktoren, insbesondere ionisierender Strahlung und Radiomimetikums Verbindungen. Die Phosphorylierung der H2A Histon-Variante H2AX, bei der Serin-139-Rest, in der hoch konservierten C-terminalen SQEY Motiv bilden γH2AX, ist eine frühe Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche
Protocol
Gewebe
- Lungengewebe, in Formen im optimalen Schneid-Temperatur (OCT)-Verbindung 4583 eingebettet ist, wurde geschnitten (5 um) mit einem CM Leica 1950 Kryostat montiert und auf Poly-L-Lysin-Slides.
Die eingefrorenen Proben wurden von Dr. Simon Royce an der Murdoch Children Research Institute erhalten. Lungengewebe wurde aus unbehandelten Balb / c Mäusen und von einem Mausmodell für chronische allergische Atemwegserkrankungen, die viele der pathologischen Merkmale der menschlichen Asthma 6 zeigt gewonnen. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Animal Ethics Committee der Murdoch Children Research Institute, die den Australian Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren zu wissenschaftlichen Zwecken haftet gesetzt durchgeführt.
- Die Schnitte wurden an der Luft getrocknet bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
Immunfluoreszenzfärbung
- Die Schnitte wurden mit 2% (w / v) Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 20 Minuten fixiert.
- Die Schnitte wurden äquilibriert mit zwei Waschungen in PBS für jeweils 15 Minuten.
- Die Schnitte wurden mit 70% Ethanol (gekühlt auf -20 ° C) für 20 Minuten durch drei Waschungen in PBS für jeweils 10 Minuten behandelt, gefolgt.
An dieser Stelle Dias können in verschlossenen Behältern bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen gelagert.
- Die Schnitte wurden dreimal mit PBS gewaschen für jeweils 10 Minuten und dann mit 100 &mgr; l frisch in PBS hergestellt, die 8% BSA in PBS mit 0,5% Tween-20 und 0,1% blockiert Triton X-100 (PBS-TT) für 1 Stunde bei Raumtemperatur .
Alle Inkubationen wurden in einem befeuchteten Färbetrog durchgeführt. - Die Schnitte wurden mit PBS-TT für 5 Minuten gewaschen und einem hydrophoben Umfang wurde um das Gewebe mit einem Pap-Stift markiert.
- Überschüssige Puffer wurde gekippt off und 100 &mgr; l der primären polyklonalen Kaninchen-anti-γH2AX Antikörper (1:500 verdünnt in 1% BSA in PBS; Millipore) wurde zu jedem Abschnitt, um eine 2-stündige Inkubation bei Raumtemperatur zugegeben.
Inkubation mit Primär-Antikörper kann über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden
Für weitere Hinweise, dass γH2AX Brennpunkte darstellen DSBs kann ein primärer Antikörper Erkennung eines DSB-Reparatur-Protein verwendet werden. Zum Beispiel ist Co-Lokalisation von γH2AX und phospho-ATM eine häufig verwendete Kombination. - Die Schnitte wurden zweimal in PBS-TT gewaschen für jeweils 5 Minuten inkubiert und mit 100 &mgr; l des sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG 1:500 verdünnt in 1% BSA; Invitrogen) für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln . (Verwässert Antikörper wurde in der Dunkelheit während des gesamten Verfahrens aufbewahrt).
- Die Schnitte wurden dreimal mit PBS-TT gewaschen für jeweils 5 Minuten inkubiert und mit 0,5-Promillegrenze RNAse A für 30 Minuten bei 37 ° C.
- Nuclear Gegenfärbung und Montage wurde mit Vectashield Medium mit Propidiumiodid durchgeführt.
- Die Objektträger wurden mit Nagellack versiegelt und über Nacht bei 4 ° C in der Dunkelheit vor der Analyse gelagert.
Mikroskopie / Analysis
- Ein Zeiss LSM510 Meta konfokale Mikroskop wurde verwendet, um Bilder mit dem Standard-GFP zu erwerben (für γH2AX - Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen-IgG) und PI (543 nm)-Laser.
Die Bilder wurden in einer Z-Serie Muster mit einer Schrittweite von 0,5 mu m erworben. Bei der Analyse wurden die einzelnen Ebenen zerlegt und gestapelt, um eine maximale projizierte Bild zu erzeugen, um die Überlappung der Herde zu minimieren.
Die Methode der Erstellung einer maximalen projizierten Bildes vor einer Partikelzahl sollte nur in Fällen, in denen ein dünner Schnitt (z. B. 5 um) verwendet wird und wo die Hintergrundfärbung ist unbedeutend verwendet werden. Wo dickeren Abschnitte mit einer bedeutenden Hintergrund analysiert werden müssen, sollte eine komplexere Analyse, wie 3D-Objekt Zähler wie Bolte und Cordelières (2006) beschriebenen 7 verwendet werden.
- Metamorph (Molecular Devices, USA) wurde verwendet, um verschmolzen (rot und grün) Bilder zu schaffen, die Zahl der Herden zu quantifizieren.
Obwohl Metamorph kann verwendet werden, um Schwerpunkte Zahlen quantifizieren, typischerweise bei der Verwendung von Gewebeschnitten Schwerpunkte sind manuell (vom Auge) für eine höhere Genauigkeit gezählt werden.
Spezifische Zelltypen von Interesse für die Quantifizierung gewählt werden, zum Beispiel Lungen-Epithelzellen. Dies kann auf der Grundlage der Histologie und mit Bezug auf Hämatoxylin und Eosin gefärbt Schnittserien durchgeführt werden.
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Discussion
Für den Zweck dieser Demonstration haben wir genutzt Maus Lungengewebe aus unbehandelten Balb / c Mäusen und von einem Mausmodell einer chronischen, allergischen Atemwegserkrankungen. Wir quantifiziert Unterschiede in der Zahl der Herde pro Zelle mit leicht höheren Durchschnitt in der geschädigten Lunge im Vergleich zu unbehandelten Abschnitten beobachtet. Insbesondere angegeben Quantifizierung 6,5 Foci pro / Zelle und 9,4 Foci pro / Zelle (manuelle Zählung von 20 Zellen pro Abschnitt), in der unbehandelten Gewebe und chronische allergische Atemwegserkrankung Gewebe bzw.. Allerdings würde die Verwendung eines DSB-induzierenden Mittel, z. B. Naphthalin, von denen bekannt ist DSBs in der Mauslunge Modell zu induzieren, Ertrag höher Brennpunkte Zahlen. In der Tat ist dieses Protokoll am meisten für die Untersuchung der Wirkung ionisierender Strahlung in Gewebe geeignet; auffälliger Ergebnisse in Bezug auf γH2AX Brennpunkte Zahlen und Auflösung erhält man, wenn ionisierende Strahlung verwendet wird. Es ist bekannt, dass nach Exposition mit Röntgenstrahlen, γH2AX Brennpunkte bilden sich rasch und Schwerpunkte Zahlen eine maximale Reichweite zwischen 30-60 Minuten 2. Daher sind 1 Stunde Zeitpunkten (post-Bestrahlung) ideal für die Bewertung ersten DSB Bildung und längere Zeiten (in der Regel bis zu 48 Stunden) kann verwendet werden, um DNA-Reparatur zu überwachen.
Insgesamt ist die Quantifizierung der γH2AX im Gewebe hilfreich für die Überwachung DSB Bildung und Reparatur. Abgesehen von seiner Nützlichkeit im Zusammenhang mit ionisierender Strahlung, kann die Methode zur Bewertung der Wirksamkeit von DSB-induzierenden Verbindungen in verschiedenen Geweben, zum Beispiel die häufig angewendeten antineoplastischen Anthrazyklinen wie Doxorubicin sind dafür bekannt, DSBs Ursache angewendet werden, und möglicherweise zu überwachen verschiedenen Pathologien, die durch reaktive Sauerstoffspezies vermittelte DSBs gekennzeichnet sind. Wichtig ist, dass dieses Protokoll für verschiedene Maus-Gewebe.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. LM wird von Melbourne Research (University of Melbourne) und Biomedical Imaging CRC zusätzliche Stipendien unterstützt. Die Unterstützung der Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody und Iska Carmichael) war von unschätzbarem Wert für diese Arbeit. MMT ist dankbar für die Unterstützung von Experten und Beratung von Dr. Olga Sedelnikova von den National Institutes of Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
