Summary
ΓH2AX odaklarının dayanarak DNA çift iplikli sonlarının kantitasyonu doku radiosensitivity ve radyasyon değiştirerek bileşikler etkileri değerlendirilmesi için, özellikle radyasyon biyoloji, paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada doku örnekleri γH2AX odaklarının kantitatif bir immünofloresan testinin kullanımını göstermek.
Abstract
DNA çift iplikli sonları (DSBs), endojen (fizyolojik veya patolojik) süreçleri veya dışsal faktörler, özellikle iyonlaştırıcı radyasyon ve radiomimetic bileşikleri de ortaya çıkabilir, özellikle ölümcül ve genotoksik lezyonlar vardır. Fosforilasyon serin-139 kalıntı H2A histon varyant, H2AX, son derece korunmuş C-terminal SQEY motifi, γH2AX oluşturan DNA çift iplikli tatili için erken bir cevap.
Protocol
Dokular
- Akciğer dokusu, optimal kesim sıcaklığında (OCT) bileşik 4583 kalıplar içine gömülü bir CM Leica 1950 Kriyostat (5 mikron) kesitli ve poli-L-lisin slaytlar monte edilmiş.
Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü'nde Dr. Simon Royce donmuş numuneler elde edilmiştir. Akciğer dokusunun tedavi edilmezse Balb / c farelerinde ve birçok insan astım 6 patolojik özellikleri gösteren kronik allerjik solunum yolları hastalığı, bir fare modelinde elde edildi. Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, bilimsel amaçlar için laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Avustralya Kanunu Uygulama yapışır Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü Hayvan Etik Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.
- Bölüm 1 saat oda sıcaklığında kurumaya izin verildi.
Immünofloresan boyaması
- Bölüm 20 dakika boyunca% 2 (w / v) fosfat paraformaldehid tamponlu salin (PBS) ile tespit edildi.
- Bölümler her biri için 15 dakika PBS içinde iki yıkar ile dengelenmiş.
- Bölüm, her biri için 10 dakika PBS üç yıkar takip 20 dakika boyunca% 70 etanol (-20 ° C ila soğutulmuş) ile tedavi edildi.
Bu noktada slaytlar 2 haftaya kadar 4 ° C'de kapalı kaplarda saklanır olabilir.
- Bölümler her biri için 10 dakika PBS ile üç defa yıkanır ve sonra taze,% 0.5 'lik Tween-20 ve% 0.1 içeren PBS içinde% 8 BSA içeren PBS içinde hazırlanan 100μL bloke oda sıcaklığında 1 saat süreyle Triton X-100 (PBS-TT) .
Tüm inkubasyon nemlendirilmiş bir boyama çukurda yapıldı. - Bölüm 5 dakika PBS-TT ile yıkandı ve hidrofobik bir çevre doku etrafında bir Pap kalem ile kutlandı.
- Aşırı tampon kapalı uçlu ve birincil tavşan poliklonal anti-γH2AX antikor (PBS içinde% 1 BSA, 1:500 sulandırılmış; Millipore) 100μl, oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon için her bölüm eklendi.
Kuluçka primer antikor ile 4 gece yapılabilir ° C
Daha fazla kanıt için, bu γH2AX odakları DSBs temsil DSB onarım protein tanıyan bir primer antikor de kullanılıyor olabilir. Örneğin, co-lokalizasyon γH2AX ve fosfor ATM yaygın olarak kullanılan bir kombinasyonudur. - Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle; bölümler her biri için 5 dakika PBS-TT iki kez yıkanır ve sekonder antikor 100μl (Invitrogen Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG% 1'lik BSA ile seyreltilmiş, 1:500) ile inkübe edildi . (Seyreltilmiş antikor prosedürü boyunca karanlıkta tutuldu).
- Bölüm üç kez her biri için 5 dakika PBS-TT ile yıkanmalı ve 37 ° 30 dakika 0.5mg/mL RNAse A ° C ile inkübe
- Nükleer counterstaining ve montaj propidium iyodür içeren Vectashield orta ile yapıldı.
- Slaytlar oje ile kapatılır ve bir gece önce 4 ° C karanlıkta analiz saklandı.
Mikroskopi / Analiz
- (- Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG γH2AX) ve PI (543 nm) lazerler Zeiss LSM510 Meta Konfokal Mikroskop standart GFP kullanarak görüntü elde etmek için kullanılır oldu.
Görüntüler bir adım boyutu 0,5 mikron ile Z-serisi bir desen elde edildi. Analizi sırasında, bireysel uçakları deconvoluted, üst üste odaklarının en aza indirmek için öngörülen azami bir görüntü elde etmek yığılmış.
Bir parçacık sayımı öncesinde maksimum yansıtılan görüntü yaratma yöntemi sadece ince bir bölümü (örneğin 5μm) ve arka plan boyama önemsiz olduğu durumlarda kullanılmalıdır. Önemli bir arka plan ile kalın bölümlerde analiz edilmelidir Bolte ve Cordelieres (2006) tarafından açıklandığı gibi, 3B Nesne Sayaç gibi daha karmaşık bir analiz 7 kullanılmalıdır.
- Metamorph (Moleküler Cihazlar, ABD) odakları numaraları ölçmek için birleşti (kırmızı ve yeşil) görüntüleri oluşturmak için kullanılmıştır.
Metamorph doku kesitlerinde odakları daha doğru elle sayılır (göz) kullanılarak tipik olarak odaklar numaraları ölçmek için kullanılan olabilir de.
Ilgi Örneğin akciğer epitel hücreleri için özel hücre tipleri, kantitatif için seçilebilir. Bu histoloji ve hematoksilen ve eosin ile boyandı seri bölümleri referans alınarak yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tedavi edilmezse Balb / c farelerinde ve fare akciğer dokusunun kronik allerjik solunum yolları hastalığı bir fare modeli kullanılan bu gösteri amacı için. Biz biraz daha yüksek tedavi edilmezse bölümlerine göre hasarlı akciğer gözlenen ortalamaları ile hücre başına odaklarının sayısındaki farklılıklar quantitated. Özellikle, sırasıyla kantitatif, tedavi edilmezse doku ve kronik alerjik solunum yolları hastalığı doku / hücre başına 6.5 odaklar ve 9.4 odaklar başına / hücre (bölüm başına 20 hücre manuel sayma) belirtilir. Ancak, örneğin naftalin, fare akciğer modeli DSBs neden olduğu bilinen bir DSB-indükleyici ajan kullanımı, yüksek odaklar numaraları doğuracak. Gerçekten de, bu protokol dokularda iyonlaştırıcı radyasyon etkilerinin araştırılması için en uygundur; γH2AX odakları numaraları ve çözünürlük açısından daha çarpıcı sonuçlar, iyonlaştırıcı radyasyon kullanıldığı zaman elde edilir. Bu X-ışınlarına maruz kalınmasının ardından hızla γH2AX odakları form ve odaklar numaraları arasında azami 30-60 dakika 2 ulaşmasını bilinir. Bu nedenle, 1 saat zaman noktalarında (ışınlama sonrası) ilk DSB oluşumu ve DNA onarım izlemek için kullanılabilir kat daha uzun (genellikle 48 saat kadar) değerlendirmek için ideal.
Genel olarak, dokularda γH2AX kantitatif DSB oluşumu ve onarım izlenmesi için yararlıdır. Iyonlaştırıcı radyasyon bağlamında kendi programını dışında, yöntem DSB-indükleyici çeşitli dokularda bileşikler, örneğin, doksorubisin gibi sık kullanılan antikanser antrasiklinler DSBs neden olduğu bilinmektedir etkinliğinin değerlendirilmesi için uygulanan olabilir, ve potansiyel olarak izlemek için , reaktif oksijen türleri aracılı DSBs ile karakterize olan çeşitli patolojiler. Önemlisi, bu protokol, farklı fare dokular için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Avustralya Nükleer Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü destek kabul edilmektedir. TCK AINSE ödül layık görüldü. Epigenomic Tıp Laboratuarı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (566.559) Avustralya tarafından desteklenmektedir. LM Melbourne Araştırma (University of Melbourne) ve Biyomedikal Görüntüleme CRC ek burs tarafından desteklenmektedir. Monash Micro Görüntüleme desteği (Dr Stephen Cody ve Iska Carmichael), bu iş için çok değerli idi. MMT Ulusal Sağlık Enstitüleri Dr Olga Sedelnikova uzman yardım ve tavsiye için minnettar olduğunu.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
