In vivo ¹⁹ F IRM pour le suivi cellulaire

Summary

Nous décrivons un protocole général pour le suivi in vivo de cellules à l'aide de l'IRM dans un modèle de souris ex vivo avec des cellules marquées. Un protocole typique pour le marquage de cellules, le traitement d'acquisition d'image et la quantification est inclus.

Abstract

In vivo ¹⁹ F IRM permet le suivi de la cellule quantitative sans l'utilisation des rayonnements ionisants. Il s'agit d'une technique non invasive qui peut être appliquée à l'homme. Ici, nous décrivons un protocole général pour le marquage cellulaire, l'imagerie et le traitement d'image. La technique est applicable à différents types cellulaires et des modèles animaux, mais ici nous nous concentrons sur un modèle de souris typique pour le suivi des cellules immunitaires de souris. Les questions les plus importantes pour le marquage cellulaire sont décrites, qui sont applicables à tous les modèles. De même, les paramètres d'imagerie sont répertoriés clés, bien que les détails peuvent varier en fonction du système d'IRM et de la configuration individuelle. Enfin, on inclut un protocole de traitement d'image pour la quantification. Variations pour cela, et d'autres parties du protocole, sont évalués dans la section Discussion. Sur la base de la procédure décrite ici en détail, l'utilisateur devra s'adapter au protocole spécifique pour chaque type de cellule, l'étiquette de la cellule, modèle animal, et la configuration de formation d'image. On notera que le protocol peut également être adapté pour une utilisation humaine, aussi longtemps que les restrictions cliniques sont remplies.

Introduction

Dans le suivi de la cellule in vivo est essentiel pour l'optimisation et le suivi des thérapeutiques cellulaires ^1. En raison de sa nature non invasive, l'imagerie offre d'excellentes possibilités de suivre des cellules in vivo. Imagerie par résonance magnétique (IRM) est indépendant de rayonnements ionisants et permet une résolution d'image supérieure et intrinsèque contraste des tissus mous. Suivi de la cellule à base d'IRM a déjà été utilisé cliniquement pour suivre les cellules dendritiques dans ^deux patients atteints de mélanome. IRM clinique conventionnel est réalisé sur le noyau ¹ H, mobiles présents dans l'eau dans les tissus. Il est également possible d'effectuer l'IRM sur d'autres noyaux actifs, tels que ¹³ C, ¹⁹ F et ²³ Na. Cependant, seulement ¹⁹ F IRM a été appliquée avec succès à vivo suivi dans la cellule car il offre la sensibilité la plus élevée après ¹ H. L'absence de l'IRM détectable endogène ¹⁹ F dans les tissus permet signal haute sélectivité pour lala détection d'agents de contraste exogènes ¹⁹ F et permet la quantification de la concentration de fluor directement à partir des données d'image. Pour une discussion détaillée sur ¹⁹ F IRM, voir ^3-5. Une question clé avec ¹⁹ F IRM est la nécessité de développer et d'optimiser les étiquettes de cellules ¹⁹ F appropriés, bien que plusieurs étiquettes ont été développés, avec une tendance à des agents multimodaux ^6.

Le protocole que nous décrivons ici est basée sur des études par nos groupes ^7-9, y compris les premiers articles qui décrivent in vivo quantitative ¹⁹ cellules à base de l'IRM F suivi ^10,11. Le mode opératoire général de cheminement de cellules en utilisant ¹⁹ F IRM est résumée sur la figure 1. Nous décrivons un protocole général pour l'étiquetage et l'imagerie des cellules dendritiques (CD) en utilisant un contraste perfluorocarbonée agent de sur-mesure ^8. Le protocole d'imagerie est généralement applicable à différents types de cellules, des étiquettes et des modèles animaux. Latype de cellule et l'animal modèle décrit ici ne doit être considéré comme un exemple, et donc nous ne fournissons pas de détails sur l'isolement cellulaire et l'étiquetage, mais plutôt se concentrer sur le protocole d'imagerie. Modifications seront nécessaires pour chaque étiquette, le type de cellule, modèle animal, et l'installation d'imagerie, et ceux-ci peuvent être trouvés dans la littérature ou peuvent avoir besoin d'être optimisé par les chercheurs. Certaines modifications communes sont incluses dans la discussion.

Protocol

Remarque: Toutes les expériences et les procédures impliquant des animaux doivent être effectués conformément aux lignes directrices éthiques pertinentes et conformes aux soins des animaux norme et les exigences humanitaires.

Une. Cellule étiquetage (protocole standard avec co-incubation)

1. Ajouter ¹⁹ F étiquette ⁸ à DC immatures à une concentration de 4 mg/10 ⁶ cellules (dans 2 ml de milieu). Agiter doucement pour mélanger.
2. Incuber les cellules avec l'étiquette pendant 3 jours avant la maturation et la récolte des pays en développement.
3. Recueillir les pays en développement et éliminer l'excès étiquette par lavage au moins 3x dans du PBS. Compter les cellules.
4. Remettre en suspension dans un petit volume de PBS pour l'injection ou d'autres essais.

Remarque: Ce protocole est pertinent pour ces pays en développement et étiquette spécifiques. La procédure a été optimisée dans une autre publication ⁸ et inclus ici ne sont que les étapes de préparation d'un échantillon à l'image, puisque l'objet de ce protocole est de l'imagerie. Hrence, le protocole pour l'isolement, de la culture et de l'étiquetage d'un type de cellule spécifique devra soit être trouvé dans la littérature ou optimisé par le chercheur. Un résumé de tous les autres ¹⁹ F étiquettes qui ont été utilisés dans la littérature est présentée ailleurs ^6.

2. Détermination de ¹⁹ F / cellule Utilisation RMN ¹⁹ F

1. Placer un nombre connu de cellules marquées (généralement supérieure à 0,5 x 10 ^6, ou un nombre qui se traduit par un signal suffisamment fort) dans un tube de RMN.
2. Ajouter 10 ul d'acide trifluoro-acétique à 5% (TFA). Si la fréquence de résonance de TFA est inadapté en raison de chevauchement avec l'étiquette, utiliser un composé soluble autre, de préférence avec un seul ¹⁹ F résonance.
3. Placer l'échantillon dans un spectromètre de RMN et d'obtenir le spectre de ¹⁹ F. Assurez-vous que la bande passante est suffisante pour à la fois le TFA (référence) et l'agent.

Remarque: Le TR doit être suffisamment longue pour full assouplissement de la référence et l'échantillon tourne (environ 5 fois T temps ₁ de relaxation T ₁ composante la plus longue dans le tube, généralement TR ~ 5-8 sec). Des spectromètres nécessitent D ₂ O pour un signal de verrouillage de fréquence. Un spectre ¹⁹ F standard est suffisant. Numéros de moyennes ou de cellules plus vastes seront nécessaires si l'absorption cellulaire de l'étiquette est mauvaise ou si le nombre de cellules est faible. Le spectre doit être centré entre la référence et les pics d'étiquettes pertinentes, sauf si des corrections sont apportées pour tenir compte de l'excitation partielle.

4. Calcul de l'aire sous les pics relatifs de la référence et de l'échantillon (ou le pic principal de l'échantillon), puis de calculer le nombre moyen de ¹⁹ F / cellule dans l'échantillon.

Remarque: L'ensemble du processus doit être répété et moyenne largement suffisant pour atteindre une signification statistique. Ceci peut également être réalisé en utilisant la spectroscopie directement à l'appareil d'IRM. Houtefois, noter que cette procédure ne révèle que la moyenne ^{de 19} F chargement d'un grand nombre de cellules, pas la variabilité entre les cellules. Vérification de l'homogénéité de l'absorption cellulaire nécessite la présence d'un composant fluorescent à l'agent de ¹⁹ F, de sorte que l'absorption cellulaire peut être analysée en utilisant la microscopie ou cytométrie de flux.

3. Considérations pour Experimental Design - Mobile injection

En raison de la relativement faible sensibilité de l'IRM ¹⁹ F pour le suivi de la cellule, un modèle animal où les cellules vont se localiser dans un grand nombre de succès est nécessaire pour l'imagerie in vivo. Des valeurs de sensibilité typiques vont de 1,000-100,000 cells/voxel/1 hr temps de cycle ^6, avec un chargement de la cellule dans la plage de 10 ¹¹ -10 ¹³ atomes de fluor.

Le nombre et la fréquence des séances d'imagerie doivent être soigneusement planifiées, comme cela influe sur le choix de l'anesthésique. Notez que l'isoflurane peut pas être suitable ¹⁹ F pour l'IRM si la fréquence de résonance F ¹⁹ de l'isoflurane est proche de celle du composé du marqueur utilisé. isoflurane peut encore convenir si les séances d'imagerie sont suffisamment court pour éviter une accumulation importante. Plusieurs anesthésiques alternatives ont été utilisées dans la littérature ^10,11; par exemple, est inclus dans le protocole d'imagerie. Peuvent avoir besoin d'être optimisé pour différentes souches de souris et des modèles de maladies anesthésiques.

4. Conception d'un ¹⁹ F Référence externe

1. Utilisez une référence externe contenant une quantité connue de ¹⁹ signal F pour la quantification ^12. Choisir l'intensité de signal de la référence d'être à peu près comparable à celle attendue de l'objet.

Remarque: En général, il est plus simple si le composé de référence est la même que l'étiquette de la cellule, pour faire correspondre les paramètres de relaxation. Si des séquences spectroscopiques ou des séquences sans localisation spatiale sont utilisés, alors acompound avec un déplacement chimique différent peut être nécessaire.

2. Modifier l'emplacement, la taille et la forme de la référence au besoin, en fonction de la région d'intérêt (ROI). Remarque: Il est généralement plus facile d'utiliser des tubes avec une section transversale uniforme pour la référence.

5. Imagerie et préparation souris

1. Diluer disponible dans le commerce kétamine et de xylazine 01:10 v / v avec du sérum physiologique pour obtenir des solutions mères de 10 mg de kétamine / ml et 2 mg / ml de xylazine.
2. Allumez le système de chauffage dans le scanner (généralement de l'air chaud) pour assurer l'alésage sera chaud avant de la souris est imagé.
3. Injecter 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine intrapéritonéale d'initier une anesthésie. Remarque: Ces doses ont été testées pour CD1 (ICR) et NU-Foxn1 ^nu vieux souris mâles de 8 semaines. D'autres souches peuvent avoir besoin de doses légèrement différentes, qui doivent être optimisés dans une expérience séparée. Cette dose permet de garder la souris anesthésiée pour unecombat 45 min. Remarque: La profondeur de l'anesthésie est normalement suffisant si l'animal ne montre aucune réaction à une pincée de pied.
4. Une fois anesthésié, placer l'animal dans un berceau de l'animal et l'immobiliser pour empêcher le mouvement pendant l'IRM. Si nécessaire, la position de la référence externe à côté de l'animal. Tant la référence et de la ROI (emplacement prévu des cellules injectées) devrait être dans le centre de la bobine. L'animal doit être relié à la température et le contrôle de la respiration pour la surveillance physiologique lors de la numérisation.
5. Couvrir les yeux de la souris avec une pommade oculaire stérile pour éviter le dessèchement pendant les séances d'imagerie longues.
6. Si le temps d'imagerie supérieure à 40 min, préparer cathéters supplémentaires pour l'injection de plus de kétamine / xylazine avant que l'animal peut se réveiller. Position deux cathéters sous-cutanés séparés avec les solutions de travail de kétamine et de xylazine. Utilisez ce cathéter pour donner la souris un 2,5 mg supplémentaires de kétamine toutes les 20 minutes après les premiers 40 min. Si nécessaire, prolonger en outre une anesthésie par injection de 0,5 mg de xylazine supplémentaire à travers le cathéter, 100 min après l'injection initiale. Dans tous les cas, le temps expérimental ne doit pas dépasser 3 heures, sauf peut-être sous anesthésie terminaux.
7. Assurez-vous que la souris est chauffée directement après la première injection et maintenue à 37 ° C la température du corps. Avec ce protocole, <80% oxygénation du sang a été détecté dans l'atmosphère de l'air à respirer. Pour prévenir les effets secondaires de l'oxygénation du sang réduit, utiliser 100% d'oxygène (0,3 L / min). La température du corps et la respiration doivent être contrôlés tout au long de toute l'expérience et jusqu'à la récupération complète de l'animal. Notez que le taux de respiration spontanée sous kétamine / xylazine est très élevé (200-250/min). Des irrégularités dans le mode de respiration, plutôt que le taux de respiration, peuvent indiquer qu'une dose plus élevée est nécessaire pour maintenir un état approprié de l'anesthésie. La souris va réveiller spontanément dans les 20-30 min AFTEr la dernière dose d'anesthésique.

Remarque: Pour le suivi de la cellule, il est nécessaire pour l'imagerie du même animal plus d'une fois. Dans ce cas, les séances d'imagerie devraient être programmées en tenant compte du temps nécessaire pour le dédouanement de l'anesthésie du système et animales directives concernant l'utilisation de l'institut.

6. Imagerie

¹ ajustements de H et de l'imagerie

1. Placez l'animal à l'intérieur du scanner afin que le retour sur investissement est dans l'isocentre en utilisant une faible résolution, analyse anatomique avec des orientations différentes de tranche (un alignement de piste).
2. Utilisez le protocole de calage régulier sur ¹ H, par exemple, une cale globale sur l'ensemble du volume intérieur de la bobine.
3. Réglez le gain d'impulsion de référence (RG), c'est à dire la puissance d'émission mesurée en dB pendant 1 ms Hermite 90 ° impulsion RF, en utilisant l'analyse d'ajustement fournies par le vendeur.

Note: Cet ajustement seravarie avec le type de bobine RF et est essentielle pour ^{le 19} F IRM car le signal sur la fréquence F ¹⁹ est généralement trop faible pour des ajustements directs. En conséquence, une estimation de la RG doit être effectué à partir de mesures sur le signal à ¹ H. Pour la transmission RF avec une bobine de surface, le ¹ H RG doit être ajustée à un plan parallèle à la bobine à travers la partie d'intérêt, pour une bobine de volume avec homogène B ₁ le profil, les paramètres exacts de l'ajustement sont moins importants.

4. Le protocole suivant de ¹⁹ impulsion de référence réglage de gain F ne fonctionne que si les deux ¹ H et ¹⁹ F transmission RF est réalisée avec la même bobine RF (simple ou double-écoute). Pour une telle installation d'imagerie, le profil de la bobine (B ₁ de champ de transmission) sur ^une H doit être proportionnel au profil de la bobine ¹⁹ F, lorsqu'un RG fixe est appliqué, c.-à-B _1,1 C * _H = _{1,19 F} B avec un accessoireortionality constante C.
   1. Pour confirmer que les profils hélicoïdaux sont proportionnels pour une configuration spécifique, d'acquérir une ¹ H et un F bascule angle carte ¹⁹ (voir la section suivante sur B ₁ correction) sur un tube très concentré ¹⁹ F, par exemple TFA dans l'eau (01:01 v / v) en utilisant identiques champs-de-vue (FOV), avance (Figure 3).
   2. En utilisant la même RG, vérifiez que les deux cartes sont identiques, sauf pour le facteur C. mondiale
   3. Une fois le ¹ H RG est déterminé, notez bien ce numéro.
5. Effectuer un classique ¹ H IRM comme une référence anatomique pour l'imagerie ¹⁹ F. Adapter le système à la ¹⁹ F la fréquence du marqueur de cellules et réaliser un ¹⁹ F MR scanner. Idéalement, le balayage d'IRM ¹⁹ F aura le même champ de vision et de sélection de coupe comme le ¹ H IRM, bien qu'habituellement avec une résolution inférieure. L'animal peut être relancé dès que l'imaginationng est terminée. traitement de l'image peut alors être effectuée en ligne.
6. Déterminer le ¹⁹ F RG via la relation dB _19F = _1H dB -20 * log ₁₀ (C). Estimer la fréquence de l'agent ¹⁹ F dans une expérience in vitro séparée.

Remarque: In vivo, la fréquence exacte peut varier légèrement d'une expérience à cause des conditions différentes dsépaisseur. Pour éviter les artefacts de déplacement chimique la fréquence exacte doit donc être déterminée dans chaque expérience ^{de 19} F MRS, si possible. Une analyse typique pour une signalisation très faible ¹⁹ F serait mondiale (impulsion d'acquérir) la spectroscopie (TR = 200 ms, NEX = 3000, TA = 10 min, BW = 50 kHz). NEX, ainsi TA, peut être considérablement réduite pour le signal haute ¹⁹ F. La ¹⁹ fréquence F de l'agent est déterminée à partir du spectre après transformation de Fourier et la correction de phase. NEX se réfère au nombre d'excitations, TA est le temps d'acquisition et BW est lala bande passante.

Remarque: Les paramètres d'imagerie typiques ⁹ sur un scanner animale dédié 11.7T/16 cm sont: Une analyse ¹ H d'imagerie anatomique à l'aide d'un turbo écho de spin (TSE) séquence avec TR / temps d'écho efficace (TE _eff) = 2200 msec/42.8 ms, 8 échos par excitation, NEX = 2, 10, 1 mm d'épaisseur de tranches consécutives, FOV = 1,92 x 1,92 cm ^2, la matrice 128 x 128, c'est à dire une résolution de 150 x 150 x 1 000 um ^3, TA = 1 min, BW = 50 kHz et un schéma de codage de phase linéaire. ^19F images ont été acquises avec la même séquence et la géométrie correspondant, mais à plus faible résolution dans le plan et BW inférieure (NEX = 256, 48 x 48 matrice, c'est à dire une résolution de 400 x 400 x 1000 um ^3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B ₁ correction
   L'utilisation d'une bobine de radiofréquence inhomogène avec B ₁ de profil, par exemple une bobine de surface, peut nuire à la quantification des ¹⁹ données depuis le signal F dépendnon seulement sur ​​la concentration ¹⁹ F mais aussi de la distance à partir de la bobine. Acquérir un B ₁ carte sur le canal ¹ de H à ¹⁹ dans les données de façon rétrospective correctes F ordre. Cela nécessite que ¹ H et ¹⁹ profils hélicoïdaux F sont identiques, sauf pour le facteur de proportionnalité C, et que le signal de fond ¹ H suffisante est fournie dans les régions de ¹⁹ F. Un exemple de protocole de correction d'une séquence d'écho de spin ¹⁹ F est présenté, à l'aide d'un simple accord Tx / Rx bobine de surface accordable à la fois ^{du 1} H et ¹⁹ C et avec _une chambre proportionnelle des profils ^13.
   1. Acquérir une carte angle de bascule ¹ H avec la méthode de l'angle de bascule de deux ^14. Acquérir un écho de gradient scan avec très long TR (> 3 fois ¹ HT ₁₎ avec un angle de basculement d'environ juste en dessous de 90 °. Près de la bobine. Acquérir un second gradient échographie, avec un RG = _1H dB -6, soit deux fois la basculeangle de la première analyse.
   2. Calculer l'angle de bascule ¹ H, α, au voxel (x, y, z) par l'intermédiaire des intensités de signal (SI) du premier et du second balayages d'écho de gradient: α (x, y, z) = arcos (SI _{GE, une} ( x, y, z) / _{GE 2SI, 2} (x, y, z)) ^14. L'angle de basculement de ¹⁹ F est identique (sauf pour le facteur 1 / C) en raison de B proportionnelle ₁ profils. Selon le principe de Faraday de la réciprocité ^15, l'atténuation de ¹⁹ F l'intensité du signal d'une vrille séquence d'écho (de α angle excitation flip, recentrage bascule angle 2α) lors de la réception du signal est att _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). L'atténuation due à l'excitation est imparfait att _Tx (x, y, z) ~ sin ³ (α (x, y, z)) ^16. L'atténuation globale s'écrit att = attRx * attTx = α * sin ³ (α) / 90 °. Notez qu'il est normalisé à 1 en cas de parfait angle de 90 ° / 180 ° excitation / recentrage de flip. Le B ₁ corrigé19 F l'image des intensités de signaux SI _{19F, corr} sont calculées via SI _{19F, corr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / att (x, y, z).
   3. Afin de comparer les intensités des signaux provenant de différentes expériences, placer un tube de référence définie par la concentration ¹⁹ F dans le champ de vision, et normaliser l'IS _{19F, corr} au signal moyen dans la référence.

Note: D'autres ¹ HB / méthodes de cartographie de l'angle de bascule ₁ peuvent être utilisés et les différentes séquences d'impulsions ¹⁹ F nécessitent des modifications de att _{Tx, 19F.} Tout type de schéma de correction B1 va introduire une erreur supplémentaire dans la procédure de quantification des cellules. Si la quantification des cellules précises est la prémisse principale, une bobine RF avec le profil de B1 homogène peut être utilisé pour contourner cette partie du protocole.

7. Traitement de l'image

1. Faire ¹ H et ¹⁹ F images de superposition
   1. Exporter les données d'imagepour la finale ^{du 1} H et ¹⁹ F magnitude images du scanner.
   2. Ouvrez les fichiers dans un programme de traitement d'image, tels que ImageJ (freeware, NIH).
   3. Effectuer des réglages d'image que nécessaire (recadrage, luminosité, contraste) en gardant les réglages de même pour toutes les images. Les ¹⁹ F images ont généralement besoin d'être rehaussée à une résolution plus élevée pour correspondre aux ¹ H images correspondantes.
   4. Rendre les ¹⁹ F images dans des fausses couleurs (sélectionnez une table de consultation différente, dans le menu "image" dans l'image J) puis superposer sur les images ¹ H correspondant afin de localiser le signal.
2. ¹⁹ F Quantification
   1. Sélectionner un F l'image ¹⁹ (image de grandeur) avec les cellules concernées et la référence visible.
   2. Dans un programme tel que Image J, dessiner ROI sur les cellules concernées, la référence et une région extérieure à l'objet (bruit).
   3. Utilisez la commande Analyserpuis mesurer (ou simplement Ctrl + M) pour calculer l'intensité moyenne de pixels dans ces régions, et leur région. Soit S (cellules) se réfèrent à l'intensité moyenne de pixels dans la ROI sur les cellules. Multiplier par le volume (= zone d'épaisseur de tranche x) afin de calculer le signal total.
   4. Calculer le SNR, par exemple en utilisant la formule SNR = 0,65 x S (cellules) / σ, où σ est l'écart type de l'intensité de pixel dans une ROI à l'extérieur de l'échantillon qui est dépourvu de tout artefact de déplacement chimique (en général dans l'air de fond) ^17. Si le SNR est inférieur à 5, une correction pour le signal à cause du bruit peut être nécessaire et peut être réalisée comme décrit par ailleurs ^{11 10.}
   5. Dans le cas contraire, calculer la quantité totale de ¹⁹ F responsable du signal dans la ROI sur la référence en multipliant la surface de la référence, dans la tranche de l'épaisseur de coupe (pour le calcul du volume) par la concentration de ¹⁹ F dans la référence,qui est connu et supposé être homogène.
   6. Multipliez cette valeur par le signal total dans le retour sur investissement sur ​​les cellules, divisé par le signal total sur la référence pour calculer le montant de ¹⁹ F dans les cellules.
   7. Calculer le nombre de cellules en divisant ce nombre par la valeur de ¹⁹ F / cellule, qui a été calculé dans la section 2.

Representative Results

Ici, nous montrons les résultats typiques pour un protocole impliquant le transfert de cellules ¹⁹ marquées F-tête chercheuse à un ganglion lymphatique de drainage. Figure 2 montre un spectre de RMN ¹⁹ F 10 ⁶ cellules marquées à l'aide d'une référence de TFA. L'installation d'imagerie a été effectuée comme décrit dans le protocole (Figure 3). Pour l'imagerie in vivo, nous avons utilisé une référence constituée d'un cylindre fermé de la même étiquette utilisée pour les cellules placées entre les pieds de la souris. Une image représentative traitée est représentée sur la Figure 4. En appliquant le protocole décrit dans la section 7.2, on a calculé un nombre de cellules d'env. 1.2 x 10 ⁶ basée sur l'image brute ¹⁹ F de grandeur.

Figure 1. Les étapes clés pour le suivi des cellules à base d'IRM ¹⁹ F. données in vivo. Figure reproduit avec la permission ^6. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Représentant spectre RMN ¹⁹ F. Le spectre montre le signal obtenu ¹⁹ Fen raison de la quantité connue de référence, dans ce cas, le TFA, et le nombre connu de cellules, étiqueté «échantillon». Ceci peut être utilisé pour calculer la quantité de fluor par cellule, ce qui est nécessaire pour la quantification in vivo à partir des données d'image MR.

Figure 3. Angle cartes bascules de tubes avec TFA dans l'eau ont été acquises à la ¹ H et ¹⁹ F canal. Le facteur de proportionnalité a été calculée à 1,03 ± 0,08 pour cette configuration. FA: angle de bascule.

Figure 4. In vivo ¹ H / F ¹⁹ images de cellules dendritiques à tête chercheuse à un ganglion lymphatique de drainage. L'illustration montre une image représentative d'une souris, avec ¹⁹ signal F visible,en fausses couleurs, dans la référence (R) et les cellules marquées. Seules les jambes de la souris ont été imagées ici. Dans cet exemple, les cellules marquées injectés migrent vers le ganglion lymphatique de drainage. Les paramètres d'imagerie sont résumés dans le texte principal. Ce chiffre est à titre indicatif seulement.

Discussion

Le protocole décrit ici décrit la procédure générale de vivo ¹⁹ F IRM suivi de la cellule. En dépit de la méthode de co-incubation décrite, il existe plusieurs protocoles différents pour marquer les cellules avec un agent de F ^19. Cependant, la co-incubation est le plus souvent utilisé, et peut être en outre optimisée par exemple par addition d'agents de transfection ^6. Le protocole actuel de marquage cellulaire dépendra du type de cellule. Seuls les étapes clés en matière d'étiquetage sont décrites dans le protocole ici. Généralement, l'étiquette est préparé et ajouté aux cellules pendant un temps choisi allant de quelques heures à quelques jours. Enfin, les cellules doivent être soigneusement lavés pour enlever l'excédent de l'étiquette, surtout si la quantification des données d'image sera effectuée ^3. Si l'agent de F ¹⁹ comprend une étiquette de fluorescence, la présence d'étiquettes à l'extérieur (ou non lié à) les cellules peuvent être détectés en utilisant la microscopie. Après marquage, il est nécessaire d'étudier la cellulela viabilité et la fonctionnalité, par rapport aux cellules non marquées (par exemple par un dosage d'exclusion au bleu trypan). Des essais de fonctionnement spécifiques aux cellules, telles que la capacité à activer les lymphocytes T dans le cas du DCS, doivent également être effectuées. Enfin, certains ^non-19 F IRM étiquettes ont un effet sur ​​la migration des cellules ^18, ces tests devraient également être inclus pour ¹⁹ F étiquettes, en particulier avec une grande cellule de chargement.

Le protocole pour le modèle animal est également fonction des besoins de l'utilisateur. Cependant, il est important de se rappeler les limites de sensibilité strictes de ¹⁹ F IRM lors de la planification des expériences. Des valeurs de sensibilité publiés vont de 1,000-00,000 cells/voxel/1 temps de ⁶ h, avec une charge de cellule dans la plage de 10 ¹¹ -10 ^{13 19} F. La sensibilité et la concentration de l'étiquette prévu dans la région d'intérêt influent également les paramètres d'imagerie. Par exemple, l'épaisseur de coupe utilisé pour le F d'image ¹⁹ peut être adj usted qui correspond à ^une des M images ou pour couvrir une zone plus épaisse (comme le ganglion lymphatique totalité ou d'une région d'intérêt dans une seule tranche). Typiquement, le ¹⁹ F imagerie est effectuée à plus basse résolution pour maximiser la détection de signaux, d'autant plus grande résolution n'est généralement pas nécessaire de distinguer des structures telles que les ganglions lymphatiques. Si le signal est suffisante, un plus grand nombre de tranches minces peut être acquis et le signal total sur le volume d'intérêt calculée à partir de celles-ci. Cependant, les paramètres optimaux devront être dérivé pour chaque application individuelle.

Nous décrivons un protocole d'anesthésie de l'injection de kétamine / xylazine éviter les gaz fluorés comme l'inhalation d'isoflurane. D'autres protocoles ont été utilisés dans la littérature de ^10,11. Cependant, dans tous les cas, ces protocoles devront être ajustés pour la souche de souris, l'âge, le sexe, la santé et la longueur et la fréquence des séances d'imagerie.

ontenu "> Plusieurs ¹⁹ F IRM séquences d'imagerie ont été utilisés pour le suivi de la cellule, pour une revue voir ^6. Notre protocole d'imagerie peut être facilement modifié pour inclure d'autres séquences d'imagerie. Cependant, la méthode de quantification décrite ici ne prend pas en compte un volume partiel effets, les écarts dans la sélection de ROI, les changements dans les paramètres de relaxation de l'étiquette in vivo, ou des changements de cellulaire ¹⁹ F chargement. Ces questions sont décrites ailleurs ^3. En bref, l'erreur a été trouvée à l'intérieur des limites tolérables pour le suivi de la cellule longitudinale ^10. Par rapport à ces travaux antérieurs, nous proposons en outre un dispositif de correction d'image pour l'utilisation de bobines RF de surface en mettant en correspondance le champ B1. Selon la configuration spécifique de la bobine RF, il est important de se rendre compte de limitations des techniques de cartographie de B1, qui ont été bien étudiée dans le cadre ^d'une IRM H ^16. Par exemple, pour le procédé de double angle présenté ici l'B1la carte est plus précise pour des paires de bascules angle légèrement inférieur à 90 ° -180 ° et ¹⁴ erreur importante peut être introduite dans d'autres régions. Pourtant, après une validation correcte in vitro, cette correction a posteriori peut encore améliorer la quantification des cellules. En général, nous recommandons la corroboration des données avec des techniques plus établies, au moins au début. Cela se fait généralement en combinaison avec d'autres techniques in vivo en imagerie, l'imagerie optique par exemple, pour aider à exclure des erreurs importantes. Dans la plupart des cas, l'évaluation histologique est nécessaire d'évaluer ¹⁹ l'emplacement de l'étiquette F et précisément pour permettre la corrélation avec les données d'imagerie. Cela peut nécessiter l'addition d'un colorant fluorescent à l'agent de F ^19.

Enfin, bien que ¹⁹ F IRM n'a pas encore été appliquée sur le suivi clinique des cellules, il serait possible de modifier ce protocole pour une utilisation humaine. Les principales modifications nécessaires seraient à effectuer autant de optimtion et la configuration préalable que possible (afin de minimiser la durée de l'objet est dans le scanner), et d'ajuster les paramètres d'imagerie pour rester dans le taux d'absorption spécifique (SAR) clinique des restrictions.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec