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सेल ट्रैकिंग के लिए विवो 19 एफ एमआरआई में

Published: November 25, 2013 doi: 10.3791/50802
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 1, 1, 2
1Department of Tumor Immunology, Nijmegen Center for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, 2In-Vivo-NMR Laboratory, Max Planck Institute for Neurological Research, 3German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

Summary

हम पूर्व vivo लेबल की कोशिकाओं के साथ एक माउस मॉडल में एमआरआई प्रयोग में vivo सेल नज़र रखने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन. सेल लेबलिंग, छवि अधिग्रहण प्रसंस्करण और मात्रा का ठहराव के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल शामिल है.

Abstract

विवो 19 में एफ एमआरआई विकिरण के उपयोग के बिना मात्रात्मक सेल ट्रैकिंग की अनुमति देता है. यह मनुष्य के लिए लागू किया जा सकता है कि एक noninvasive तकनीक है. यहाँ, हम सेल लेबलिंग, इमेजिंग, और छवि प्रसंस्करण के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन. यहाँ हम murine प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर नज़र रखने के लिए एक विशिष्ट माउस मॉडल पर ध्यान केंद्रित हालांकि तकनीक, सेल प्रकार और पशु मॉडल विभिन्न करने के लिए लागू है. इन सभी मॉडलों के लिए प्रासंगिक हैं के रूप में सेल लेबलिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण मुद्दों, वर्णित हैं. विवरण एमआरआई प्रणाली और व्यक्तिगत स्थापना के आधार पर अलग अलग होंगे, हालांकि इसी प्रकार, कुंजी इमेजिंग मापदंडों, सूचीबद्ध हैं. अंत में, हम मात्रा का ठहराव के लिए एक छवि प्रसंस्करण प्रोटोकॉल शामिल हैं. इस के लिए बदलाव, और प्रोटोकॉल के अन्य भागों, चर्चा अनुभाग में मूल्यांकन कर रहे हैं. यहाँ वर्णित विस्तृत प्रक्रिया के आधार पर, उपयोगकर्ता एक विशेष सेल प्रकार, सेल लेबल, पशु मॉडल, और इमेजिंग स्थापना के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलन की आवश्यकता होगी. ध्यान दें कि पीrotocol भी रूप में लंबे समय नैदानिक ​​प्रतिबंध मुलाकात कर रहे हैं, के रूप में मानव उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

विवो सेल ट्रैकिंग में सेलुलर चिकित्सा विज्ञान 1 के अनुकूलन और निगरानी के लिए आवश्यक है. इसकी वजह से noninvasive प्रकृति को, इमेजिंग vivo में कोशिकाओं की निगरानी के लिए बेहतरीन अवसर प्रदान करता है. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) विकिरण से स्वतंत्र है और एक बेहतर इमेजिंग संकल्प और आंतरिक नरम ऊतक विपरीत की अनुमति देता है. एमआरआई आधारित सेल ट्रैकिंग पहले से ही मेलेनोमा रोगियों 2 में वृक्ष के समान कोशिकाओं का पालन करने के लिए चिकित्सकीय इस्तेमाल किया गया है. परम्परागत नैदानिक ​​एमआरआई ऊतकों में मोबाइल पानी में मौजूद 1 एच नाभिक, पर बाहर किया जाता है. यह इस तरह के 13 सी, 19 एफ और 23 ना ही अन्य सक्रिय नाभिक, पर एमआरआई बाहर ले जाने के लिए भी संभव है. हालांकि, केवल 19 एफ एमआरआई यह 1 एच. के बाद उच्चतम संवेदनशीलता प्रदान करता है के रूप में vivo सेल ट्रैकिंग को सफलतापूर्वक लागू किया गया है ऊतकों में एमआरआई detectable अंतर्जात 19 एफ के अभाव के लिए उच्च संकेत चयनात्मकता परमिटएक्सोजेनस 19 एफ विपरीत एजेंटों का पता लगाने और अनुमति देता छवि डेटा से सीधे फ्लोरीन एकाग्रता की मात्रा का ठहराव. 19 एफ एमआरआई पर एक विस्तृत चर्चा के लिए, 3-5 से देखते हैं. 19 एफ एमआरआई के साथ एक प्रमुख मुद्दा कई लेबल बहुविध एजेंटों 6 की दिशा में एक प्रवृत्ति के साथ विकसित किया गया है, हालांकि, उपयुक्त 19 एफ सेल लेबल के विकास और अनुकूलन करने की आवश्यकता है.

हम यहाँ वर्णन प्रोटोकॉल 10,11 ट्रैकिंग में विवो मात्रात्मक 19 एफ एमआरआई आधारित सेल वर्णित है कि पहले लेख सहित हमारे समूह 7-9, द्वारा अध्ययन पर आधारित है. 19 एफ एमआरआई प्रयोग सेल ट्रैकिंग की सामान्य प्रक्रिया चित्रा 1 में संक्षेप. हम एक कस्टम निर्मित perfluorocarbon विपरीत एजेंट 8 का उपयोग वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) की लेबलिंग और इमेजिंग के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन. इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रकार की कोशिकाओं, लेबल और पशु मॉडल अलग करने के लिए आम तौर पर लागू है.यहाँ वर्णित सेल प्रकार और पशु मॉडल केवल एक उदाहरण के रूप में लिया जाना चाहिए, और इस तरह हम सेल अलगाव और लेबलिंग पर जानकारी प्रदान करते हैं, बल्कि इमेजिंग प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित नहीं है. संशोधन प्रत्येक लेबल, सेल प्रकार, पशु मॉडल, और इमेजिंग स्थापना के लिए आवश्यक हो जाएगा, और इन साहित्य में पाया जा सकता है या शोधकर्ताओं द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है. कुछ आम संशोधनों चर्चा में शामिल किए गए हैं.

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Protocol

नोट: जानवरों को शामिल सभी प्रयोगों और प्रक्रियाओं प्रासंगिक नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है और मानक जानवरों की देखभाल और मानवीय आवश्यकताओं के अनुरूप किया जाना चाहिए.

1. सेल लेबलिंग (Coincubation साथ मानक प्रोटोकॉल)

  1. (2 मिलीलीटर मध्यम में) 4 mg/10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में अपरिपक्व DCs के लिए 19 एफ लेबल 8 जोड़ें. मिश्रण करने के लिए धीरे भंवर.
  2. DCs परिपक्व और फसल कटाई से पहले 3 दिनों के लिए लेबल के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  3. DCs लीजिए और पीबीएस में धोने के लिए कम से कम 3x से अतिरिक्त लेबल हटा दें. कक्षों की गणना.
  4. इंजेक्शन या आगे के परीक्षण के लिए पीबीएस की एक छोटी मात्रा में Resuspend.

नोट: इस प्रोटोकॉल इन विशिष्ट DCs और लेबल के लिए प्रासंगिक है. इस प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित इमेजिंग पर है क्योंकि प्रक्रिया, एक और प्रकाशन 8 में अनुकूलित और शामिल यहाँ छवि के लिए एक नमूना तैयार करने के लिए ही कदम उठाए हैं रहा था. एचखिलाडि़यों, अलगाव, संस्कृति और एक विशेष सेल प्रकार की लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल साहित्य में पाया या शोधकर्ता द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी. साहित्य में प्रयोग किया गया है कि सभी अन्य 19 एफ लेबल का एक सारांश कहीं 6 प्रस्तुत किया है.

2. 19 एफ एनएमआर का उपयोग 19 एफ / सेल का निर्धारण

  1. एक एनएमआर ट्यूब में लेबल कोशिकाओं का एक ज्ञात संख्या (आमतौर पर अधिक से अधिक 0.5 x 10 6, या पर्याप्त संकेत में यह परिणाम है कि एक नंबर) रखें.
  2. 5% trifluoroacetic एसिड (TFA) के 10 μl जोड़ें. TFA के अनुनाद आवृत्ति लेबल के साथ ओवरलैप की वजह से अनुपयुक्त है, अधिमानतः एक एकल 19 एफ गूंज के साथ, एक वैकल्पिक घुलनशील यौगिक का उपयोग करें.
  3. एक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में नमूना प्लेस और 19 एफ स्पेक्ट्रम प्राप्त करते हैं. बैंडविड्थ TFA (संदर्भ) और एजेंट दोनों के लिए पर्याप्त है कि यह सुनिश्चित करें.

नोट: टी.आर. च के लिए काफी लंबा होना चाहिएULL संदर्भ में छूट और नमूना spins (ट्यूब में सबसे लंबे समय तक टी 1 घटक के लगभग 5 गुना 1 टी विश्राम का समय, आमतौर पर टी.आर. ~ 5-8 सेकंड). कुछ स्पेक्ट्रोमीटर एक आवृत्ति ताला संकेत के लिए डी 2 हे की आवश्यकता होती है. एक मानक 19 एफ स्पेक्ट्रम पर्याप्त है. सेल नंबर कम हैं तो लेबल की सेल तेज गरीब है या अगर व्यापक औसत या उच्च सेल नंबर की आवश्यकता होगी. सुधार आंशिक उत्तेजना के लिए खाते के लिए किया जाता है जब तक कि स्पेक्ट्रम, संदर्भ और प्रासंगिक लेबल चोटियों के बीच केंद्रित किया जाना चाहिए.

  1. संदर्भ और नमूना (या नमूना के मुख्य शिखर) की चोटियों के तहत सापेक्ष क्षेत्रों की गणना, और फिर नमूने में 19 एफ / सेल की औसत संख्या की गणना.

नोट: पूरी प्रक्रिया को दोहराया और सांख्यिकीय महत्व तक पहुंचने के लिए काफी बड़े पैमाने पर औसतन किया जाना चाहिए. इस एमआरआई स्कैनर पर सीधे स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग भी किया जा सकता है. एचowever, इस प्रक्रिया कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या है, नहीं की कोशिकाओं के बीच परिवर्तनशीलता के लिए केवल औसत 19 एफ लोड हो रहा है पता चलता है कि ध्यान दें. तेज सेल की एकरूपता जांच की जा रही 19 एफ एजेंट पर एक फ्लोरोसेंट घटक की उपस्थिति की आवश्यकता है, इसलिए कि सेल तेज माइक्रोस्कोपी का उपयोग या प्रवाह cytometry विश्लेषण किया जा सकता है.

3. सेल इंजेक्शन - प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए विचार

कारण सेल ट्रैकिंग, कोशिकाओं बड़ी संख्या में स्थानीय बनाना होगा जहां एक पशु मॉडल के लिए 19 एफ एमआरआई के अपेक्षाकृत गरीब संवेदनशीलता vivo इमेजिंग में सफल के लिए आवश्यक है. संवेदनशीलता के विशिष्ट मानों 10 11 -10 13 फ्लोरीन परमाणुओं की श्रृंखला में एक सेल लदान के साथ, 1,000-100,000 cells/voxel/1 घंटा से स्कैन करने का समय 6 सीमा होती है.

इस संवेदनाहारी की पसंद को प्रभावित करती है के रूप में इमेजिंग सत्र की संख्या और आवृत्ति सावधानी से योजना बनाई जानी चाहिए. कि isoflurane suitabl नहीं हो सकता है ध्यान दें19 एफ एमआरआई के लिए ई isoflurane के 19 एफ अनुनाद आवृत्ति लेबल जो परिसर के करीब है. इमेजिंग सत्र महत्वपूर्ण बिल्ड अप को रोकने के लिए काफी कम कर रहे हैं अगर isoflurane अभी भी उपयुक्त हो सकता है. कई वैकल्पिक एनेस्थेटिक्स साहित्य 10,11 में इस्तेमाल किया गया है, एक उदाहरण इमेजिंग प्रोटोकॉल में शामिल है. Anesthetics अलग माउस उपभेदों और रोग मॉडल के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है.

4. एक बाहरी 19 एफ संदर्भ का डिजाइन

  1. मात्रा का ठहराव 12 के लिए 19 एफ संकेत के एक ज्ञात मात्रा युक्त एक बाहरी संदर्भ का उपयोग करें. विषय से उम्मीद है कि मोटे तौर पर बराबर हो संदर्भ के संकेत तीव्रता चुनें.

नोट: संदर्भ परिसर छूट मापदंडों से मेल करने के लिए, सेल लेबल के रूप में ही है, तो आम तौर पर, यह आसान है. स्थानिक स्थानीयकरण बिना स्पेक्ट्रोस्कोपी दृश्यों या दृश्यों का उपयोग किया जाता है, तो एसीompound एक अलग रासायनिक बदलाव के साथ आवश्यक हो सकता है.

  1. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र पर निर्भर आवश्यक रूप स्थान, आकार और संदर्भ के आकार, संशोधित करें. नोट: यह संदर्भ के लिए एक समान पार अनुभाग के साथ ट्यूब का उपयोग करने के लिए आम तौर पर सबसे आसान है.

5. इमेजिंग और माउस तैयारी

  1. 10 मिलीग्राम / एमएल ketamine के शेयर समाधान और 2 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine उपज के लिए शारीरिक खारा के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ketamine और xylazine 1:10 वी / वी पतला.
  2. माउस imaged है पहले बोर गर्म हो जाएगा सुनिश्चित करने के लिए स्कैनर (आमतौर पर गर्म हवा) में हीटिंग सिस्टम चालू करें.
  3. 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine इंजेक्षन और 10 मिलीग्राम / किलो xylazine intraperitoneal संज्ञाहरण आरंभ करने के लिए. नोट: ये खुराक CD1 (आईसीआर) और परमाणु Foxn1 परमाणु 8 सप्ताह पुराने नर चूहों के लिए परीक्षण किया गया है. अन्य उपभेदों एक अलग प्रयोग में अनुकूलित किया जाना चाहिए जो थोड़ा अलग खुराकों की आवश्यकता हो सकती. इस खुराक एक के लिए anesthetized माउस रखेंगेमुक्केबाज़ी 45 मिनट. नोट: पशु एक पैर चुटकी तक कोई प्रतिक्रिया से पता चलता है कि अगर संज्ञाहरण की गहराई सामान्य रूप से पर्याप्त है.
  4. Anesthetized एक बार, एक जानवर पालने में जानवरों की जगह और एमआरआई के दौरान गति को रोकने के लिए स्थिर करना. यदि आवश्यक हो, अगले पशु के लिए बाहरी संदर्भ की स्थिति. संदर्भ और रॉय (इंजेक्शन कोशिकाओं की उम्मीद स्थान) दोनों कुंडली के केंद्र में होना चाहिए. पशु स्कैनिंग के दौरान शारीरिक निगरानी के लिए तापमान और सांस लेने के नियंत्रण से जुड़ा होना चाहिए.
  5. लंबे इमेजिंग सत्र के दौरान बाहर सुखाने से रोकने के लिए बाँझ नेत्र मरहम के साथ माउस की आँखों को कवर किया.
  6. इमेजिंग समय 40 मिनट से अधिक है जानवर जाग सकता है, इससे पहले अतिरिक्त ketamine / xylazine के इंजेक्शन के लिए अतिरिक्त कैथेटर तैयार करते हैं. Ketamine और xylazine का काम कर समाधान के साथ स्थिति दो अलग चमड़े के नीचे कैथेटर. माउस पहले 40 मिनट के बाद ketamine के एक अतिरिक्त 2.5 मिलीग्राम हर 20 मिनट देने के लिए इस कैथेटर का उपयोग. यदि आवश्यक हो, आगे प्रारंभिक इंजेक्शन के बाद, कैथेटर के माध्यम से अतिरिक्त 0.5 मिलीग्राम xylazine के इंजेक्शन से 100 मिनट संज्ञाहरण लम्बा. सभी मामलों में, प्रयोगात्मक समय संभवतः टर्मिनल संज्ञाहरण के तहत अलावा 3 घंटा, अधिक नहीं होनी चाहिए.
  7. माउस पहले इंजेक्शन के बाद सीधे गर्म और 37 डिग्री सेल्सियस शरीर के तापमान पर रखा जाता है कि सुनिश्चित करें. इस प्रोटोकॉल के साथ, <80% रक्त oxygenation वातावरण हवा में सांस लेने के नीचे पाया गया. , कम रक्त oxygenation से दुष्प्रभावों को रोकने के लिए 100% ऑक्सीजन (0.3 एल / मिनट) का उपयोग करें. शरीर का तापमान और सांस लेने के लिए पूरे प्रयोग के दौरान और जानवर की पूरी वसूली तक नियंत्रित किया जाना चाहिए. Ketamine / xylazine के तहत सहज साँस लेने की दर (200-250/min) बहुत अधिक है कि ध्यान दें. सांस लेने पैटर्न, बजाय साँस लेने की दर में अनियमितताएं, एक उच्च खुराक संज्ञाहरण का एक उपयुक्त स्थिति बनाए रखने के लिए आवश्यक है कि संकेत कर सकते हैं. माउस का करि 20-30 मिनट के भीतर अनायास जगाने होगाआर संवेदनाहारी के अंतिम खुराक.

नोट: सेल ट्रैकिंग के लिए, यह अधिक से अधिक एक बार में एक ही पशु छवि के लिए आवश्यक है. उस मामले में, इमेजिंग सत्र संस्थान की प्रणाली और जानवरों के उपयोग के दिशा निर्देशों से संज्ञाहरण की निकासी के लिए आवश्यक समय के लिए ध्यान के साथ निर्धारित किया जाना चाहिए.

6. इमेजिंग

1 एच समायोजन और इमेजिंग

  1. आरओआई अलग टुकड़ा झुकाव के साथ एक कम संकल्प, संरचनात्मक स्कैन (एक localizer) का उपयोग isocenter में इतना है कि स्कैनर के अंदर पशु रखें.
  2. उदाहरण के तार के अंदर पूरी मात्रा पर एक वैश्विक शिम 1 एच, पर नियमित shimming प्रोटोकॉल का प्रयोग करें.
  3. विक्रेता द्वारा प्रदान समायोजन स्कैन का उपयोग कर, Hermite 90 ° आरएफ नाड़ी एक 1 मिसे के लिए डीबी में मापा शक्ति ट्रांसमीटर यानी संदर्भ पल्स लाभ (आरजी), समायोजित करें.

नोट: यह समायोजन होगाआरएफ कुंडली के प्रकार के साथ बदलती हैं और 19 एफ आवृत्ति पर संकेत सीधे समायोजन के लिए आमतौर पर बहुत कम है क्योंकि 19 एफ एमआरआई के लिए आवश्यक है. एक परिणाम के रूप में, आरजी के एक अनुमान 1 एच संकेत पर माप से किया जाना चाहिए. एक सतह का तार के साथ आरएफ संचरण के लिए, 1 एच आरजी समरूप बी 1 प्रोफाइल के साथ एक मात्रा का तार के लिए, ब्याज का हिस्सा के माध्यम से तार करने के लिए एक विमान समानांतर करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, समायोजन की सटीक सेटिंग्स कम महत्वपूर्ण हैं.

  1. 1 एच और 19 एफ आरएफ संचरण दोनों एक ही (एक या दो देखते) आरएफ तार के साथ किया जाता है केवल यदि 19 एफ संदर्भ पल्स लाभ समायोजन की निम्नलिखित प्रोटोकॉल काम करता है. इस तरह के एक इमेजिंग सेटअप के लिए 1 एच पर कुंडली प्रोफाइल (बी 1 संचारित क्षेत्र) एक निश्चित आरजी लागू किया जाता है जब 19 एफ कुंडल प्रोफाइल, के लिए आनुपातिक होना चाहिए, यानी बी 1,1 एच = सी बी * 1,19 एफ एक सहारा के साथortionality निरंतर सी.
    1. कि कुंडली प्रोफाइल एक विशिष्ट स्थापना के लिए आनुपातिक हैं पुष्टि करने के लिए, एक 1 एच और एक 19 एफ फ्लिप कोण नक्शा हासिल अत्यधिक (1:1 वी पानी में 19 एफ, जैसे TFA केंद्रित के साथ एक ट्यूब पर (बी 1 सुधार पर निम्न अनुभाग देखें) / वी) (चित्रा 3) पहले,) समान क्षेत्रों का दृश्य (FOVs का उपयोग कर.
    2. एक ही आरजी का प्रयोग, दोनों नक्शे वैश्विक कारक सी. के अलावा समान हैं कि जाँच
    3. 1 एच आरजी निर्धारित हो जाने के बाद इस संख्या में कमी को ध्यान दें.
  2. बाहर ले जाने के लिए एक पारंपरिक 1 एच एमआरआई 19 एफ इमेजिंग के लिए एक संरचनात्मक संदर्भ के रूप में स्कैन. सेल मार्कर के 19 एफ आवृत्ति को धुन प्रणाली और एक 19 एफ एमआर स्कैन बाहर ले. आदर्श रूप में 19 एफ एमआरआई स्कैन होगा एक ही क्षेत्र का दृश्य और 1 एच एमआरआई के रूप में टुकड़ा चयन, आमतौर पर कम संकल्प के साथ यद्यपि. पशु के रूप में जल्द ही imagi के रूप में पुनर्जीवित किया जा सकता हैएनजी पूरा हो गया है. इमेज प्रोसेसिंग तो ऑफ़लाइन किया जा सकता है.
  3. संबंध डीबी 19F = डीबी 1H के माध्यम से 19 एफ आरजी निर्धारण करते -20 * 10 (सी) लॉग ऑन करें. एक अलग इन विट्रो प्रयोग में 19 एफ एजेंट आवृत्ति का अनुमान है.

नोट: विवो में, सटीक आवृत्ति अलग shimming शर्तों की वजह से प्रयोग करने के लिए प्रयोग से थोड़ा भिन्न हो सकते हैं. यदि संभव हो तो सटीक आवृत्ति इसलिए, 19 एफ मिसेज से प्रत्येक प्रयोग में निर्धारित किया जाना चाहिए रासायनिक पारी कलाकृतियों को रोकने के लिए. बहुत कम 19 एफ संकेत के लिए एक विशिष्ट स्कैन ग्लोबल (नाड़ी अधिग्रहण) स्पेक्ट्रोस्कोपी (टी.आर. = 200 मिसे, नेक्स = 3000, टीए = 10 मिनट, BW = 50 kHz) होगा. नेक्स, इस प्रकार टीए, नाटकीय रूप से उच्च 19 एफ संकेत के लिए कम किया जा सकता है. 19 एफ एजेंट आवृत्ति फूरियर परिवर्तन और चरण सुधार के बाद स्पेक्ट्रम से निर्धारित होता है. नेक्स excitations की संख्या को संदर्भित करता है, टीए अधिग्रहण समय है और BW हैबैंडविड्थ.

नोट: एक 11.7T/16 सेमी समर्पित पशु स्कैनर पर विशिष्ट इमेजिंग मापदंडों 9 हैं: एक शारीरिक 1 एच इमेजिंग एक टर्बो स्पिन गूंज (त्से) अनुक्रम टी.आर. / प्रभावी गूंज समय (ते EFF) के साथ उपयोग कर स्कैन = 2200 msec/42.8 मिसे, उत्तेजना के अनुसार 8 गूँज, नेक्स = 2, लगातार 10, 1 मिमी मोटी स्लाइस, FOV = 1.92 X 1.92 सेमी 2, 128 x 128 मैट्रिक्स, यानी 150 x 150 x 1000 माइक्रोन 3, टीए = 1 मिनट, BW = 50 के एक संकल्प kHz और एक रैखिक चरण एन्कोडिंग योजना. 19 एफ छवियों उसी क्रम और मिलान ज्यामिति के साथ प्राप्त कर लिया गया है, लेकिन कम में विमान संकल्प और कम BW पर (नेक्स = 256, 48 x 48 मैट्रिक्स, यानी 400 x 400 x 1000 के एक संकल्प माइक्रोन 3, टीए = 57 मिनट, BW = 10 kHz).

  1. बी 1 सुधार
    संकेत निर्भर करता है के बाद से inhomogeneous बी 1 प्रोफाइल, जैसे एक सतह का तार के साथ एक आरएफ तार का उपयोग, 19 एफ डेटा की मात्रा का ठहराव प्रभावित कर सकते हैंन केवल 19 एफ एकाग्रता पर भी कुंडली से दूरी पर. पूर्वव्यापी सही 19 एफ डेटा के क्रम में 1 घंटे के चैनल पर एक बी 1 का नक्शा मोल. इस 1 एच और 19 एफ कुंडल प्रोफाइल्स समानता कारक सी के लिए छोड़कर समान हैं कि आवश्यकता है, और है कि पर्याप्त 1 एच पृष्ठभूमि संकेत 19 एफ के क्षेत्रों में प्रदान की जाती है एक 19 एफ स्पिन गूंज अनुक्रम के सुधार के लिए एक उदाहरण प्रोटोकॉल 1 एच और 19 एफ दोनों को एक ही देखते TX / RX सतह कुंडल tunable का उपयोग कर प्रस्तुत किया और आनुपातिक बी 1 प्रोफाइल के 13 के साथ है.
    1. दो फ्लिप कोण विधि 14 के साथ एक 1 एच फ्लिप कोण नक्शा मोल. बस के नीचे 90 डिग्री के एक अनुमान के अनुसार फ्लिप कोण के साथ एक ढाल गूंज स्कैन के साथ बहुत लंबे टी.आर. (> 3 बार 1 एचटी 1) मोल. कुंडली के करीब है. एक आरजी के साथ एक दूसरे ढाल गूंज स्कैन मोल = डीबी 1H -6, यानी दो बार फ्लिपपहले स्कैन के कोण.
    2. 1 एच फ्लिप कोण की गणना, α, voxel पहले और दूसरे ढाल गूंज स्कैन के संकेत तीव्रता (एसआई) के माध्यम से (एक्स, वाई, जेड) है: α (एक्स, वाई, जेड) = Arcos (एसआई जीई, 1 ( एक्स, वाई, जेड) / 2SI जीई, 2 (एक्स, वाई, जेड)) 14. 19 एफ फ्लिप कोण के कारण आनुपातिक बी 1 प्रोफाइल के लिए (कारक 1 / सी के लिए छोड़कर) के समान है. पारस्परिकता 15, संकेत स्वागत के दौरान एक स्पिन गूंज अनुक्रम (उत्तेजना फ्लिप कोण α, फ्लिप कोण 2α refocusing) से 19 एफ संकेत तीव्रता के क्षीणन की फैराडे के सिद्धांत के अनुसार RX (एक्स, वाई, जेड) ~ α (एक्स, वाई ATT है , Z). कारण अपूर्ण उत्तेजना को क्षीणन टीएक्स (एक्स, वाई, जेड) ~ पाप 3 (α (एक्स, वाई, जेड)) 16 ATT है. समग्र क्षीणन ATT = attRx * attTx = α * पाप 3 (α) / 90 ° रूप में लिखा है. यह सही 90 ° / 180 ° / उत्तेजना refocusing फ्लिप कोण के मामले में 1 सामान्यीकृत है कि ध्यान दें. बी 1 में सुधार19 एफ छवि संकेत तीव्रता एसआई 19F, Corr एसआई 19F, Corr (एक्स, वाई, जेड) = एसआई 19F (एक्स, वाई, जेड) / ATT (एक्स, वाई, जेड) के माध्यम से गणना कर रहे हैं.
    3. , विभिन्न प्रयोगों से संकेत तीव्रता तुलना देखने के क्षेत्र में निर्धारित 19 एफ एकाग्रता के साथ एक संदर्भ ट्यूब जगह है, और संदर्भ में मतलब संकेत करने के लिए एसआई 19F, Corr मानक के अनुसार करने के लिए.

नोट: अन्य 1 एचबी 1 / फ्लिप कोण मानचित्रण तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है और अलग अलग 19 एफ पल्स दृश्यों टीएक्स, 19F att के बदलाव की जरूरत नहीं. बी 1 सुधार योजना की किसी भी तरह की कोशिका मात्रा का ठहराव प्रक्रिया में अतिरिक्त त्रुटि परिचय देंगे. सही सेल मात्रा का ठहराव मुख्य आधार है, तो समरूप बी 1 प्रोफाइल के साथ एक आरएफ कुंडल प्रोटोकॉल के इस भाग को नाकाम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

7. इमेज प्रोसेसिंग

  1. 1 एच और 19 एफ ओवरले चित्र बनाने
    1. छवि डेटा निर्यात करेंअंतिम 1 एच और स्कैनर से 19 एफ परिमाण छवियों के लिए.
    2. ऐसे ImageJ (फ्रीवेयर, एनआईएच) के रूप में एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम में फाइलें, खोलें.
    3. सभी छवियों के लिए एक ही समायोजन रखते हुए आवश्यक (फसल, चमक, इसके विपरीत) के रूप में छवि समायोजन के लिए बाहर ले. 19 एफ छवियों आम तौर पर संगत 1 एच छवियों मैच के लिए एक उच्च संकल्प upscaled करने की आवश्यकता होगी.
    4. (छवि जम्मू में "छवि" मेनू के तहत, एक अलग देखो के टेबल का चयन) और फिर संकेत स्थानीय बनाना करने के क्रम में संगत 1 एच छवियों पर उपरिशायी झूठी रंग में 19 एफ छवियों को प्रस्तुत करना.
  2. 19 एफ मात्रा
    1. प्रासंगिक कोशिकाओं और दृश्य संदर्भ के साथ एक 19 एफ छवि (परिमाण छवि) का चयन करें.
    2. ऐसी छवि जम्मू के रूप में एक कार्यक्रम में प्रासंगिक कोशिकाओं, विषय (शोर) के बाहर संदर्भ और एक क्षेत्र पर ROIs आकर्षित.
    3. आदेश विश्लेषण का प्रयोग करेंऔर फिर उपाय (या बस Ctrl + एम) इन क्षेत्रों के भीतर मतलब पिक्सेल तीव्रता की गणना करने के लिए, और उनके क्षेत्र. एस (सेल) कोशिकाओं ओवर में मतलब पिक्सेल तीव्रता का उल्लेख कर दें. कुल संकेत की गणना करने के लिए खंड (= क्षेत्र एक्स टुकड़ा मोटाई) से गुणा कि.
    4. SNR की गणना सूत्र SNR का उपयोग कर उदाहरण के लिए = 0.65 एक्स एस (कोशिकाओं) / σ, जहां σ (आमतौर पर पृष्ठभूमि हवा में) किसी भी रासायनिक बदलाव विरूपण साक्ष्य के लिए स्वतंत्र है जो नमूना बाहर एक रॉय में पिक्सेल तीव्रता का मानक विचलन है 17. SNR 5 के तहत है, तो शोर की वजह से संकेत के लिए एक सुधार आवश्यक हो सकता है और कहीं 11 से 10 के रूप में वर्णित किया जा सकता है.
    5. अन्यथा, संदर्भ में 19 एफ की एकाग्रता द्वारा टुकड़ा मोटाई (मात्रा की गणना करने के लिए) द्वारा टुकड़ा में संदर्भ के क्षेत्र गुणा करके संदर्भ ओवर में संकेत के लिए जिम्मेदार 19 एफ की कुल राशि की गणना,जाना जाता है और सजातीय होना मान लिया है.
    6. कोशिकाओं में 19 एफ की राशि की गणना करने के लिए संदर्भ पर कुल संकेत द्वारा विभाजित कोशिकाओं ओवर में कुल संकेत, द्वारा कि मूल्य गुणा.
    7. धारा 2 में गणना की गई जो 19 एफ / सेल, के लिए मूल्य उस संख्या से विभाजित करके कोशिकाओं की संख्या की गणना.

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Representative Results

यहाँ हम एक draining लिम्फ नोड के लिए घर वापस आना 19 एफ लेबल की कोशिकाओं के हस्तांतरण को शामिल एक प्रोटोकॉल के लिए ठेठ परिणाम दिखाते हैं. चित्रा 2 एक TFA संदर्भ का उपयोग कर 10 6 लेबल की कोशिकाओं के एक 19 एफ एनएमआर स्पेक्ट्रम को दर्शाता है. प्रोटोकॉल (चित्रा 3) के रूप में वर्णित इमेजिंग सेटअप किया गया. Vivo इमेजिंग के लिए, हम माउस के पैरों के बीच रखा कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल एक ही लेबल के एक मोहरबंद सिलेंडर से मिलकर एक संदर्भ का उपयोग किया. एक प्रतिनिधि संसाधित छवि चित्रा 4 में दिखाया गया है. खंड 7.2 में वर्णित प्रोटोकॉल लागू करके, हम लगभग एक सेल संख्या की गणना. 1.2 x 10 6 कच्चे 19 एफ परिमाण छवि पर आधारित है.

चित्रा 1
चित्रा 1. 19 एफ एमआरआई आधारित सेल ट्रैकिंग के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए. vivo में डेटा की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है. चित्रा अनुमति 6 के साथ reproduced. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि 19 एफ एनएमआर स्पेक्ट्रम. स्पेक्ट्रम प्राप्त 19 एफ संकेत से पता चलता हैकारण इस मामले में TFA संदर्भ के ज्ञात राशि, और "नमूना" लेबल की कोशिकाओं के ज्ञात संख्या, करने के लिए. इस एमआर छवि डेटा से vivo में मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक है, जो सेल प्रति फ्लोरीन की मात्रा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. पानी में TFA साथ ट्यूब का दूसरा कोण नक्शे 1 एच और 19 एफ चैनल पर हासिल किया गया. समानता कारक इस स्थापना के लिए 1.03 ± 0.08 होने की गणना की गई. एफए: कोण फ्लिप.

चित्रा 4
चित्रा 4. में vivo 1 एच / 19 एक draining लिम्फ नोड के लिए घर वापस आना वृक्ष के समान कोशिकाओं के एफ छवि. आंकड़ा 19 एफ संकेत दिखाई दे साथ, एक माउस के एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है,झूठी रंग में, संदर्भ (नि.) और लेबल की कोशिकाओं में. माउस का केवल पैर यहाँ imaged थे. इस उदाहरण में, इंजेक्शन लेबल कोशिकाओं draining लिम्फ नोड के लिए चले गए. इमेजिंग मापदंडों मुख्य पाठ में संक्षेप हैं. चित्रा चित्रण प्रयोजनों के लिए ही है.

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Discussion

यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल में विवो 19 एफ एमआरआई सेल ट्रैकिंग के लिए सामान्य प्रक्रिया का वर्णन करता है. वर्णित सह ऊष्मायन विधि के बावजूद, एक 19 एफ एजेंट के साथ कोशिकाओं लेबलिंग के लिए कई अलग अलग प्रोटोकॉल रहे हैं. हालांकि, सह ऊष्मायन सबसे अक्सर इस्तेमाल किया जाता है और आगे अभिकर्मक एजेंट 6 के अलावा द्वारा जैसे अनुकूलित किया जा सकता है. वास्तविक सेल लेबलिंग प्रोटोकॉल सेल प्रकार पर निर्भर करेगा. केवल मुख्य लेबलिंग कदम यहाँ प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. आम तौर पर, लेबल कुछ घंटों से कुछ दिनों से लेकर एक चयनित समय के लिए तैयार है और कोशिकाओं को जोड़ा जाता है. अंत में, कोशिकाओं छवि डेटा से मात्रा का ठहराव 3 बाहर किया जाएगा, खासकर अगर लेबल के किसी भी अधिक दूर करने के लिए ध्यान से धोया जाना चाहिए. 19 एफ एजेंट एक प्रतिदीप्ति टैग, बाहर (या नहीं करने के लिए बाध्य) लेबल की उपस्थिति भी शामिल हैं कोशिकाओं माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर पाया जा सकता है. लेबलिंग के बाद, यह सेल अध्ययन करने के लिए आवश्यक है(trypan नीले बहिष्कार परख द्वारा जैसे) nonlabeled कोशिकाओं के संबंध में व्यवहार्यता और कार्यक्षमता,. ऐसे DCs के मामले में टी कोशिकाओं को सक्रिय करने की क्षमता के रूप में सेल विशिष्ट कार्यक्षमता परीक्षण, भी बाहर किया जाना चाहिए. कुछ गैर-19 एफ एमआरआई लेबल सेल प्रवास 18 पर एक प्रभाव है के रूप में अंत में, इस तरह के परीक्षण भी विशेष रूप से उच्च सेल लोड के साथ 19 एफ लेबल, के लिए शामिल किया जाना चाहिए.

पशु मॉडल के लिए प्रोटोकॉल भी उपयोगकर्ता की जरूरतों पर निर्भर है. हालांकि, यह प्रयोगों की योजना बनाते समय 19 एफ एमआरआई की सख्त संवेदनशीलता सीमा याद रखना महत्वपूर्ण है. प्रकाशित संवेदनशीलता मूल्यों 10 11 -10 13 19 एफ के रेंज में एक सेल लदान के साथ, 1,000-00,000 cells/voxel/1 घंटा समय 6 से लेकर ब्याज के क्षेत्र में संवेदनशीलता और उम्मीद लेबल एकाग्रता भी इमेजिंग मापदंडों प्रभाव. उदाहरण के लिए, 19 एफ छवि के लिए इस्तेमाल टुकड़ा मोटाई adj किया जा सकता है usted 1 एच छवियों की है कि मैच के लिए या (जैसे पूरे लिम्फ नोड या एक टुकड़ा में रुचि के क्षेत्र के रूप में) एक बहुत मोटा क्षेत्र को कवर करने के लिए. आमतौर पर, 19 एफ इमेजिंग उच्च संकल्प आमतौर पर इस तरह के लिम्फ नोड्स के रूप में संरचनाओं भेद करने के लिए आवश्यक नहीं है, खासकर जब से संकेत का पता लगाने को अधिकतम करने के लिए कम संकल्प पर किया जाता है. संकेत पर्याप्त है, तो पतले स्लाइस की एक बड़ी संख्या को हासिल कर लिया और इन से गणना ब्याज की मात्रा पर कुल संकेत किया जा सकता है. हालांकि, इष्टतम मापदंडों व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक आवेदन के लिए प्राप्त किया जा करने की आवश्यकता होगी.

हम ketamine / xylazine isoflurane तरह fluorinated साँस लेना गैसों से बचने के साथ एक इंजेक्शन संज्ञाहरण प्रोटोकॉल का वर्णन. अन्य प्रोटोकॉल साहित्य 10,11 में इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, सभी मामलों में, इन प्रोटोकॉल माउस तनाव, उम्र, लिंग, स्वास्थ्य और इमेजिंग सत्र की लंबाई और आवृत्ति के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी.

"ontent> कई 19 एफ एमआरआई इमेजिंग दृश्यों 6 देखना एक समीक्षा के लिए, सेल ट्रैकिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है. हमारे इमेजिंग प्रोटोकॉल तत्काल अन्य इमेजिंग दृश्यों में शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. हालांकि, यहां वर्णित मात्रा का ठहराव विधि खाते में किसी भी आंशिक मात्रा नहीं ले करता है प्रभाव, ROIs के चयन में विसंगतियों, vivo में लेबल की छूट मापदंडों में परिवर्तन, या सेलुलर 19 एफ लदान में बदल जाता है. इन मुद्दों अन्यत्र 3 वर्णित हैं. संक्षेप में, त्रुटि अनुदैर्ध्य सेल ट्रैकिंग के लिए सहनीय सीमा के भीतर होना पाया गया है 10. इन पहले काम की तुलना में हम साथ ही बी 1 क्षेत्र मानचित्रण द्वारा सतह आरएफ coils के उपयोग के लिए एक छवि सुधार योजना का प्रस्ताव. विशिष्ट आरएफ कुंडल सेटअप के आधार पर यह किया गया है, जो बी 1 मानचित्रण तकनीक की सीमाओं के बारे में पता होना जरूरी है . उदाहरण के लिए, यहाँ B1 प्रस्तुत डबल कोण विधि के लिए 1 एच एमआरआई 16 के संदर्भ में अच्छी तरह से अध्ययनमानचित्र पर सिर्फ 90 ° -180 ° 14 नीचे और महत्वपूर्ण त्रुटि अन्य क्षेत्रों में पेश किया जा सकता फ्लिप कोण जोड़े के लिए सबसे सही है. फिर भी, इन विट्रो में उचित सत्यापन के बाद, इस तरह के पूर्वव्यापी सुधार आगे सेल मात्रा का ठहराव सुधार कर सकते हैं. सामान्य में, हम कम से कम शुरू में, अधिक की स्थापना की तकनीक के साथ डेटा की मंडन की सलाह देते हैं. यह आमतौर पर बड़ी त्रुटियों को बाहर करने में मदद करने के लिए अन्य vivo इमेजिंग तकनीक, जैसे ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ संयोजन में किया जाता है. ज्यादातर मामलों में, ऊतकीय मूल्यांकन ठीक 19 एफ लेबल स्थान का आकलन करने के लिए और इमेजिंग डेटा के साथ संबंध की अनुमति आवश्यक है. इस 19 एफ एजेंट को एक फ्लोरोसेंट डाई के अलावा आवश्यकता हो सकती है.

19 एफ एमआरआई अभी तक क्लिनिकल सेल ट्रैकिंग के लिए लागू नहीं किया गया है, हालांकि अंत में, यह मानव उपयोग के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए संभव हो जाएगा. आवश्यक मुख्य संशोधनों OPTIM के रूप में ज्यादा के लिए बाहर ले जाने के लिए किया जाएगाization और पहले से ही संभव सेटअप (विषय स्कैनर में है समय की लंबाई कम करने के लिए), और नैदानिक ​​विशिष्ट अवशोषण दर (एसएआर) के प्रतिबंध के भीतर रखने के लिए इमेजिंग मापदंडों को समायोजित करने के लिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के हितों का कोई टकराव है.

Acknowledgments

हम उनके बहुमूल्य सहायता के लिए नादिन Henn और Arend Heerschap स्वीकार करना चाहते हैं. इस काम रिजनरेटिव मेडिसिन के नीदरलैंड संस्थान (एनआईआरएम, FES0908), यूरोपीय संघ FP7 कार्यक्रम ENCITE (स्वास्थ्य F5-2008-201842) और TargetBraIn (स्वास्थ्य F2-2012-279017), वोक्सवैगन फाउंडेशन से अनुदान (द्वारा समर्थित किया गया I/83 443), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (VENI 700.10.409 और Vidi 917.76.363), ईआरसी (उन्नत अनुदान 269,019), और Radboud विश्वविद्यालय Nijmegen मेडिकल सेंटर (AGIKO-2008-2-4).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
PBS Sigma-Aldrich MFCD00131855
TFA Sigma-Aldrich 76-05-1
Ketamine (Ketavet) Pfizer 778-551
Xylazine (Rompun) Bayer QN05 cm92
Ophtosan Produlab Pharma 2702 eye ointment
Material name
MRI scanner Bruker Biospec
NMR spectrometer Bruker Biospec

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References

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चिकित्सा अंक 81 पशु मॉडल प्रतिरक्षा प्रणाली रोग एमआरआई, सेल ट्रैकिंग मात्रा सेल लेबल,
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Srinivas, M., Boehm-Sturm, P., Aswendt, M., Pracht, E. D., Figdor, C. G., de Vries, I. J., Hoehn, M. In vivo 19F MRI for Cell Tracking. J. Vis. Exp. (81), e50802, doi:10.3791/50802 (2013).

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