세포 추적을위한 생체 ¹⁹ F MRI에서

Summary

우리는 생체 표지 세포와 마우스 모델에서 MRI를 사용하여 생체 내 세포 추적을위한 일반적인 프로토콜을 설명합니다. 셀 라벨, 이미지 수집 처리 및 정량화를위한​​ 일반적인 프로토콜이 포함되어 있습니다.

Abstract

생체 내에서 ¹⁹ F MRI는 전리 방사선의 사용없이 정량적 셀 추적을 허용한다. 이는 인간에게 적용될 수있다 비침 기술이다. 여기, 우리는 셀 라벨, 영상 및 이미지 처리를 위해 일반적으로 프로토콜을 설명합니다. 여기에서 우리는 뮤린 면역 세포의 추적을위한 전형적인 마우스 모델에 초점 비록 기술은, 세포 유형 및 다양한 동물 모델에 적용 가능하다. 이러한 모든 모델에 관련된으로 셀 라벨의 가장 중요한 문제는, 설명합니다. 자세한 내용은 MRI 시스템과 각각의 설정에 따라 달라질 수 있지만, 마찬가지로 키 이미지 매개 변수가 나열되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 정량화를위한​​ 이미지 처리 프로토콜을 포함한다. 이 변형을하고, 프로토콜의 다른 부분은 토론 섹션에서 평가됩니다. 여기에 설명 된 세부 절차에 기초하여, 사용자는 각각의 특정 세포 유형, 세포 라벨, 동물 모델 및 촬상 셋업 프로토콜을 적용해야한다. 참고 Protocol도만큼 임상 제한이 충족 될 때, 사람의 사용을 위해 적응 될 수있다.

Introduction

생체 내 세포 추적에 세포 치료제 ^1의 최적화 및 모니터링을 위해 필수적입니다. 그것의 비 침습적 인 특성으로, 영상은 생체 내에서 세포를 모니터링하는 훌륭한 기회를 제공합니다. 자기 공명 영상 (MRI)은 이온화 방사선 독립적이며 뛰어난 이미지 해상도 및 고유의 부드러운 조직의 대비를 할 수 있습니다. MRI 기반 세포 추적은 이미 흑색 종 환자 ² 수지상 세포를 수행하기 위해 임상 적으로 사용되었습니다. 기존의 임상 MRI는 조직에서 모바일 물에 존재하는 ¹ H 핵에 실시한다. 그런 ¹³ C, ¹⁹ F 및 ²³ 나 다른 활성 핵에서 MRI를 수행하는 것도 가능하다. 그러나, ¹⁹ F MRI는 ¹ H. 이후 가장 높은 감도를 제공으로 생체 내 세포 추적에 성공적으로 적용되었습니다 조직에서 ^MRI-19 F 검출 내생의 부재에 대해 높은 신호 선택성 허용외인성 ¹⁹ F 조영제의 검출 및 허용 화상 데이터로부터 직접적으로 불소 농도의 정량. ¹⁹ F MRI에 대한 자세한 설명은 ^3-5를 참조하십시오. ¹⁹ F MRI와 핵심 문제는 몇 개의 라벨이 복합 제제 ⁶ 향한 트렌드와 함께, 개발되었지만, 적합한 ¹⁹ F 셀 라벨을 개발하고 최적화 할 필요가있다.

우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 ^{10, 11를} 추적하는 생체 정량적 ¹⁹ F MRI 기반의 셀을 설명하는 첫 번째 기사를 포함하여 우리의 그룹 ^7-9으로 연구를 기반으로합니다. ¹⁹ F MRI를 사용하여 세포 추적의 일반적인 절차는 그림 1에 요약되어있다. 우리는 사용자 정의 - 만든 퍼플 루오로 카본 조영제 ^8을 사용하여 수지상 세포의 라벨 및 이미징을위한 일반적인 프로토콜을 설명합니다. 이미징 프로토콜은 세포 유형, 상표 및 동물 모델 다른 일반적으로 적용 할 수있다.여기에 설명 된 셀 타입 및 동물 모델은 예를 들어 이동해야하고, 따라서 우리는 세포 격리 및 라벨에 관한 세부 정보를 제공 할뿐만 아니라 촬상 프로토콜에 집중하지 않는다. 개조는 각각의 라벨, 세포 분류, 동물 모델, 촬상 설정에 필요한 것, 및 이들 문헌에서 찾을 수 또는 연구자에 의해 최적화 될 필요가있다. 일반적인 수정은 토론에 포함되어 있습니다.

Protocol

주 : 동물을 포함한 모든 실험과 절차는 관련 윤리 지침에 따라 실시 및 표준 동물 관리 및 인도적 요구 사항을 준수해야합니다.

1. 셀 라벨 (Coincubation와 표준 프로토콜)

1. (2 ㎖ 매체에서) 4 mg/10 ⁶ 세포의 농도로 미성숙 수지상에 ¹⁹ F 레이블 ^{추가 8.} 혼합 부드럽게 소용돌이.
2. DC의 성숙 및 수확 전에 3 일 동안 레이블 세포를 품어.
3. 수지상를 수집하고 PBS 세척 적어도 3 배에 의해 초과 라벨을 제거합니다. 세포를 계산합니다.
4. 주사 또는 추가 테스트를위한 PBS의 작은 부피에 재현 탁.

참고 :이 프로토콜은 이러한 특정 수지상 및 레이블 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 초점은 촬상에 이후 절차는 다른 간행물 ⁸ 최적화 및 여기에 포함 된 이미지에 샘플을 제조하는 단계이다 만 하였다. H줬어은, 절연, 문화와 특정 세포 유형의 라벨에 대한 프로토콜은 문헌에서 찾을 수 또는 연구원으로 최적화해야합니다 하나. 문헌에 사용 된 모든 다른 ¹⁹ F 레이블의 요약은 다른 ⁶ 표시됩니다.

2. ¹⁹ F NMR을 사용하여 ¹⁹ F / 셀의 결정

1. NMR 튜브에 표시된 세포의 알려진 숫자 (일반적으로 0.5 × 10 ^6, 충분한 신호 결과 숫자)를 놓습니다.
2. 5 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)의 10 μl를 추가합니다. TFA의 공진 주파수는 라벨과 중첩하기 때문에 적합하지 않으면, 바람직하게는 ¹⁹ 번의 F 공진과, 대체 가용성 화합물을 사용한다.
3. NMR 분광계에 샘플을 놓고 ¹⁹ F 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. 대역폭이 TFA (참고)와 에이전트 모두에 대한 충분한 지 확인합니다.

참고 : TR은 F 충분히 길어야한다ULL의 참조의 휴식과 샘플 회전 (튜브에서 가장 긴 T ₁ 성분의 약 5 배 T ₁ 휴식 시간을, 일반적으로 TR ~ 5-8 초). 일부 분석기는 주파수 로크 신호 D ₂ O를 필요로한다. 표준 ¹⁹ F 스펙트럼은 충분하다. 세포의 숫자가 낮은 경우 라벨의 세포 흡수가 좋지 않거나 경우 광범위한 평균 이상 세포 숫자가 필요합니다. 수정이 부분 여기에 대해 설명하기 위해 만든되지 않는 스펙트럼은, 기준 및 관련 라벨 봉우리 사이를 중심으로해야한다.

4. 기준 시료 (또는 시료의 주 피크)의 피크 하에서 상대 영역을 계산하고, 다음 샘플 ^(19)의 F / 세포의 평균 수를 계산한다.

참고 : 전체 과정을 반복하고 통계적 유의성에 도달 할 정도로 광범위하게 평균을해야합니다. 이것은 MRI 스캐너 직접 분광법을 사용하여 또한 행해질 수있다. However,이 절차는 다수의 셀이 아닌 셀 사이의 변화 만 평균 ¹⁹ F 로딩을 알 수 있습니다. 세포 흡수의 균일 성을 확인하는 ¹⁹ F 에이전트에서 형광 구성 요소의 존재가 필요하므로 해당 셀의 흡수는 현미경을 사용하여 또는 유동 세포 계측법 분석 할 수 있습니다.

3. 세포 주입 - 실험 설계에 대한 고려 사항

인해 세포 추적, 세포가 많은 수에 집중한다 동물 모델의 ¹⁹ F MRI의 상대적으로 가난한 감도는 생체 내 이미징에 성공적으로 필요합니다. 전형적인 감도 값은 10 ⁽¹¹⁾ -10 ⁽¹³⁾ 불소 원자의 범위에있는 셀 로딩으로, 1,000 ~ 100,000 cells/voxel/1 열연에서 스캔 ^{시간을 6} 범위.

이 마취제의 선택에 영향을 미치는로 영상 세션의 수와 주파수는 신중하게 계획해야합니다. 그 이소 플루 란이 suitabl하지 않을 수도 있습니다¹⁹ F MRI에 대한 전자 이소 플루 란의 ¹⁹ F의 공진 주파수가 사용되는 라벨 화합물에 가까운 경우. 영상 세션이 상당한 축적을 방지하기 위해 충분히 짧은 경우 이소 플루 란은 여전히​​ 적합 할 수있다. 몇몇 대안 마취제는 문헌 ^10,11 사용되고있다; 예 촬상 프로토콜에 포함된다. 마취제는 다른 마우스 종자 및 질병 모델에 맞게 최적화 할 필요가 있습니다.

4. 외부 ¹⁹ F 참조 디자인

1. 정량화 ^{(12) 19} F 신호의 알려진 양을 포함하는 외부 참조를 사용합니다. 주제에서 예상되는 것과 거의 유사한 것으로 기준의 신호 강도를 선택합니다.

주 : 기준 화합물이 휴식 매개 변수와 일치하는 셀 라벨과 같은 경우 일반적으로, 간단합니다. 공간 지역화없이 분광 시퀀스 또는 시퀀스가​​ 사용되는 경우, ACompound 다른 화학적 변화로 필요할 수 있습니다.

2. 관심 (ROI)의 영역에 따라 필요에 따라 위치, 크기 및 참조의 모양을 수정합니다. 참고 : 참고로 균일 한 단면으로 튜브를 사용하는 것이 일반적으로 가장 쉬운 방법입니다.

5. 이미징 및 마우스 준비

1. 10 ㎎ / ㎖의 케타민 (ketamine) 원액을 2 ㎎ / ㎖ 자일 라진을 산출하기 위해 생리 식염수로 시중에서 케타민과 자일 라진 1시 10분 V / V를 희석.
2. 마우스가 이미지가되기 전에 구멍이 따뜻해질 수 있도록 스캐너 (일반적으로 따뜻한 공기)에 난방 시스템을 켭니다.
3. 100 ㎎ / kg 케타민을 주사 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 복강 마취를 시작합니다. 참고 :이 복용 CD1 (ICR) 및 NU-Foxn1의 ^뉴 8 주령의 수컷 마우스에 대해 테스트되었습니다. 다른 변종은 별도의 실험에서 최적화되어야한다 약간 다른 복용을 필요로 할 수도있다. 이 용량에 마취 마우스를 유지합니다시합 45 분. 주 : 동물이 발 핀치에 아무런 반응을 보이지 않고있는 경우 마취의 깊이는 일반적으로 충분하다.
4. 마취 후, 동물 크래들에 동물을 배치하고 MRI 동안 움직임을 방지하기 위해 고정시킨다. 필요한 경우, 다음 동물에 대한 외부 참조를 배치합니다. 참조 및 ROI (분사 셀의 예상 위치)은 모두 코일의 중심에 있어야한다. 동물은 주사하는 동안 생리 학적 모니터링을위한 온도와 호흡 조절에 연결해야합니다.
5. 긴 영상 세션 동안 건조 방지하기 위해 무균 눈 연고와 마우스의 눈을 감아 라.
6. 촬영 시간이 40 분을 초과하는 경우에는 동물이 일어날 수 있습니다 전에, 추가 케타민 / 자일 라진 주사에 대한 추가 카테터를 준비합니다. 케타민 (ketamine)과 자일 라진의 작업 솔루션과 위치 두 개의 피하 카테터. 마우스에게 처음 40 분 후 마취제의 추가 2.5 MG 매 20 분을 제공하는이 카테터를 사용하여. 필요한 경우, 상기 초기 주입 후, 카테터를 통해 추가로 0.5 밀리그램 자일 라진의 주사에 의해 100 분 마취을 연장. 모든 경우에, 실험 시간이 가능한 단말기 마취를 제외하고 3 시간을 초과하지 않아야합니다.
7. 마우스가 첫 번째 주사 후 직접 따뜻하게하고 37 ° C의 체온 유지되어 있는지 확인합니다. 이 프로토콜을 사용하여, <80 %의 혈액 산소는 대기의 공기를 호흡​​에서 검출되었다. , 하강 혈액 산소화에서 부작용을 방지 산소 100 % (0.3 L / 분)을 사용. 체온과 호흡이 전체 실험을하는 동안과 동물의 전체 복구 할 때까지 제어 할 수 있어야합니다. 케타민 / 자일 라진에서 자발적 호흡 속도 (200-250/min) 매우 높은합니다. 호흡 패턴보다는 호흡 속도의 불규칙, 높은 복용량이 마취의 적합한 상태를 유지하는 것이 필요하다는 것을 나타낼 수 있습니다. 마우스가 afte 20 ~ 30 분 이내에 자연적으로 보게 될 것이다R 마취의 마지막 복용량.

참고 : 셀 추적의 경우,이 두 번 이상 같은 동물의 이미지가 필요합니다. 그 경우, 촬상 세션 학회 시스템 및 동물 용 지침에서 마취의 정리에 필요한 시간을 고려하여 스케줄한다.

6. 영상

¹ H 조정 및 이미징

1. 투자 수익 (ROI)은 다른 슬라이스 방향과 낮은 해상도, 해부학 적 검사 (지역화)를 사용하여 등각에 있도록 스캐너 내부에 동물을 배치합니다.
2. 예를 들어, 코일 내부의 전체 볼륨에 글로벌 심 ^{1 시간에} 정규 shimming 프로토콜을 사용합니다.
3. 공급 업체에서 제공하는 조정 스캔을 사용하여, 미트 90 ° RF 펄스 1 밀리 초는 dB로 측정 송신기 전력 즉, 기준 펄스 이득 (RG)을 조정합니다.

참고 :이 조정 것RF 코일의 종류에 따라 다양하며, ¹⁹ F 주파수의 신호가 직접 조정을 위해 일반적으로 너무 낮기 때문에 ¹⁹ F MRI 필수적이다. 결과적으로, RG의 추정은 ¹ H 신호에 대한 측정으로부터 만들어 져야한다. 표면 코일 RF 송신을 위해, ¹ H의 RG는 동질 B _한 프로파일 볼륨 강대에 대하여, 그 부분을 통해 코일에 평행 한 평면으로 조정되어야 조절 실 설정은 덜 중요하다.

4. ¹ H ¹⁹ F RF 전송이 모두 동일 (단일 또는 이중 조정) RF 코일로 수행되는 경우에만 ¹⁹ F 참조 펄스 게인 조정의 다음과 같은 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이러한 촬상 셋업, ¹ H에 코일 프로파일 (B ₁ 송신 필드) 고정 RG가 적용된 ¹⁹ F 코일 프로파일에 비례해야, 즉 B _{1,1 H} = C * B _{1,19 F} 소품과 함께ortionality 일정 C.
   1. 그 코일 프로파일 특정 설정을위한 비례 확인하려면, ¹ H와 ¹⁹ F 플립 각도의지도를 취득 높은 (1:1 V 물에 ¹⁹ F, 예를 들어, TFA를 농축 튜브 (B ₁ 보정에 다음 섹션 참조) / V) (그림 3) 사전에) 동일한 필드 -보기 (영상 범위를 사용하여.
   2. 같은 RG를 사용하여, 두지도는 글로벌 인자 C.를 제외하고 동일한 지 확인
   3. ¹ H RG가 결정되면,이 번호를주지.
5. 수행 기존의 ¹ H MRI는 ¹⁹ F 영상에 대한 해부학 적 기준으로 검사합니다. 세포 마커의 ¹⁹ F 주파수에 튜닝 시스템과 ¹⁹ F MR 스캔을 실시한다. 이상적으로 ¹⁹ F MRI 스캔 것 같은 시야와 ¹ H MRI로 슬라이스 선택, 일반적으로 낮은 해상도 있지만.에게 동물은 즉시 이마 기로서 부활 할 수 있습니다NG가 완료됩니다. 화상 처리는 오프라인에서 수행 될 수있다.
6. 관계 dB _19F = dB _1H를 통해 ¹⁹ F RG를 결정 -20 * ₁₀ (C)를 ​​기록합니다. 별도의 시험 관내 실험에서 ¹⁹ F 에이전트 주파수를 추정하고있다.

주 : 생체 내에서, 정확한 주파수가 다른 shimming 조건에 의한 실험을 실험과 약간 다를 수 있습니다. 가능하면 정확한 주파수 따라서 ¹⁹ F MRS하여 각 실험에서 결정되어야 케미컬 시프트 아티팩트를 방지 할 수있다. 매우 낮은 ¹⁹ F 신호에 대한 일반적인 검사는 글로벌 (펄스 취득) 분광법 (TR = 200 밀리 초, NEX = 3000, TA = 10 분, BW = 50 kHz에서) 일 것입니다. NEX 따라서 TA는, 극적으로 높은 ¹⁹ F 신호에 대해 감소 될 수있다. ¹⁹ F 에이전트 주파수는 푸리에 변환 및 위상 보정 후의 스펙트럼으로부터 결정된다. NEX는 음원 정보의 수를 의미, TA는 획득 시간과 BW는 있습니다대역폭을 제공합니다.

참고 : 11.7T/16 cm 전용 동물 스캐너에 일반적인 이미지 매개 변수 ^(9)가있다 : 해부학 ¹ H 이미징 터보 스핀 에코 (TSE) 순서 TR / 효과적인 에코 시간 (TE의 _EFF)과을 사용하여 스캔 = 2,200 msec/42.8 밀리 초, 여기에 8 에코, NEX는 = 2, 10 년 연속 1 mm 두께의 조각, FOV = 1.92 X 1.92 cm ^2, 128 x 128의 행렬, 즉 150 X 150 X 1,000 μm의 ^3, TA = 1 분, BW = 50의 해상도 kHz와 선형 위상 인코딩 방식. ¹⁹ F 이미지는 동일한 순서와 일치하는 형상으로 획득하지만, 한 낮은 평면 해상도와 낮은 BW에 (NEX = 256, 48 x 48 매트릭스, 즉 400 X 400 X 1000의 해상도 μm의 ^3, TA = 57 분, BW = 10 kHz에서).

7. B ₁ 보정
   신호 의존하기 때문에 불균일 _한 프로파일 B, 예 표면 코일 RF 코일을 이용하여, ¹⁹ F 데이터의 정량화를 방해 할뿐만 아니라 ¹⁹ F 농도에뿐만 아니라 코일의 거리에. 소급 올바른 ¹⁹ F 데이터에 순서대로 ¹ H 채널에 B _1지도를 획득. 이것은 ¹ H 및 ¹⁹ F 코일 프로필 비례 계수 C를 제외한 동일하다는 것을 필요로하고, 충분한 ¹ H 배경 신호는 ¹⁹ F.의 영역에 제공된다 ¹⁹ F 스핀 에코 시퀀스의 보정의 예 프로토콜은 ¹ H ¹⁹ F 모두에 단일 조정 송 / 수신 표면 코일 튜너 블을 사용하여 제시하고 비례 B ₁ 프로파일 ^{(13)에있다.}
   1. 두 플립 각도 방법 ^{(14)과 1} H 플립 각도의지도를 획득. 바로 아래 90 °의 추정 플립 각도와 기울기 에코 스캔 매우 긴 TR (> 3 회 ¹ HT ₁₎ 취득. 코일에 닫습니다. RG와 두 번째 그라데이션 에코 검사를 취득 = dB _1H -6, 즉 두 번 플립첫 번째 스캔의 각도.
   2. ¹ H 플립 각도를 계산, α, 복셀, 제 1 및 제 2 구배 에코 스캔 신호 강도 (SI)를 통해 (x, y, z)에서 : α (x, y, z) = 아르 코스 (SI _{GE, 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^{14. 19} F 플립 각도로 인해 비례 B ₁ 프로파일 (요소 1 / C 제외)과 동일하다. 상호 ^(15), 신호 수신시 스핀 에코 시퀀스 (여기 플립 각도 α, 플립 각도 2α 다시 초점을 맞 춥니 다) ¹⁹ F 신호 강도의 감쇠 패러데이의 원리에 따라 _수신 (X, Y, Z) ~ α (X, Y, AT & T입니다 , z). 때문에 불완전 여기에 감쇠는 _텍사스 (X, Y, Z) ~ 죄 ³ (α (X, Y, Z)) ¹⁶ AT & T이다. 전체 감쇠는 AT & T는 = attRx * attTx = α의 *의 죄 ³ (α) / 90 °로 기록됩니다. 완벽 90 ° / 180 ° 여자 / 재 집속 플립 각도의 경우에는 1로 표준화되어 있습니다. B ₍₁₎ 수정19 F 화상 신호 강도 SI _{19F, 19F CORR는 SI, CORR} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / ATT (x, y, z)을 통해 계산된다.
   3. 다른 실험으로부터의 신호 강도와 비교 시야에서 정의한 ¹⁹ F 농도 기준 관을 배치하고, 상기 기준의 평균 신호 SI _{19F, corr를 정상화하기} 위해.

주의 : 다른 ^한 HB ₁ / 플립 각도 매핑 방법이 사용될 수 있고, 다른 ¹⁹ F 펄스 시퀀스 _{TX, 19F} ATT의 수정을 요구한다. B1 보정 방식의 모든 종류의 세포 정량화 절차에서 추가 오류를 소개합니다. 정확한 셀 정량화 대전제이면 균질 B1 프로파일 RF 코​​일은 프로토콜의이 부분을 회피하는데 사용될 수있다.

7. 이미지 처리

1. ¹ H ¹⁹ F 오버레이 이미지 만들기
   1. 이미지 데이터를 내보내기최종 ¹ H 및 스캐너에서 ¹⁹ F의 크기의 이미지.
   2. 같은 ImageJ에 (프리웨어, NIH)과 같은 이미지 처리 프로그램에서 파일을 엽니 다.
   3. 모든 이미지에 동일한 조정을 유지 필요 (자르기, 밝기, 대비)로 이미지 조정을 수행하십시오. ¹⁹ F 이미지는 일반적으로 해당하는 ¹ H 이미지에 맞게 높은 해상도로 업 스케일 할 필요가있을 것이다.
   4. (이미지 J의 "이미지"메뉴에서 다른 룩업 테이블을 선택) 한 다음 신호를 집중하기 위해 해당 ¹ H 이미지에 오버레이 거짓 색상의 ¹⁹ F의 이미지를 렌더링합니다.
2. ¹⁹ F 정량화
   1. 관련 세포 및 표시를 참조하여 ¹⁹ F 이미지 (크기의 이미지)을 선택합니다.
   2. 같은 이미지 J 등의 프로그램에서 관련 세포, 대상 (노이즈) 외부 참조 및 영역에의 ROI를 그립니다.
   3. 명령이 분석 사용다음 측정 (또는 단순히 Ctrl 키 + M)이 지역 내에서의 평균 픽셀 강도를 계산하고, 자신의 영역입니다. S (세포) 세포를 통해 투자 수익 (ROI)의 평균 픽셀 강도를 참조하자. 전체 신호를 계산하는 볼륨 (= 면적 X 슬라이스 두께)에 의해 그것을 곱합니다.
   4. SNR을 계산, 수식 SNR을 사용하여 예를 들어 = 0.65 X의 S (셀) / σ 여기서, σ (일반적으로 배경 공기에서) 어떤 화학 변화 이슈의 무료 샘플 외부의 투자 수익 (ROI)의 픽셀 강도의 표준 편차 ^17. SNR이 5 미만인 경우, 노이즈로 인한 신호에 대한 보정이 필요할 수 있고, 그 밖에 ^{11 10} 바와 같이 수행 될 수있다.
   5. 그렇지 않으면, 레퍼런스 ¹⁹ F의 농도에 의한 슬라이스 두께 (용적은 계산)에 의해 슬라이스의 참조 영역을 곱하여 기준 이상의 ROI에서의 신호에 대해 책임 ¹⁹ F의 총량을 계산공지 균일하다고 가정된다.
   6. 셀 ⁽¹⁹⁾ F의 양을 계산하는 기준 위에 전체 신호로 나누어 세포 이상의 ROI에서 전체 신호에 의해 그 값을 곱한다.
   7. 섹션 2에서 계산 된 ¹⁹ F / 셀에 대한 값으로 해당 번호를 분할하여 세포의 수를 계산한다.

Representative Results

여기에서 우리는 배수 림프절에 원점 복귀 ¹⁹ F-라벨 세포의 이동과 관련된 프로토콜에 대한 일반적인 결과를 보여줍니다. 그림 2는 TFA 참조를 사용하여 10 ⁶ 표지 세포의 ¹⁹ F NMR 스펙트럼을 보여줍니다. 프로토콜 (도 3)에서 설명한 촬상 설정 행했다. 생체 내 이미징을 위해, 우리는 쥐의 다리 사이에 배치 된 셀에 대해 사용 된 동일한 라벨의 밀봉 된 실린더로 구성된 기준을 사용했다. 대표적인 처리 된 이미지는도 4에 도시된다. 7.2 절에 설명 된 프로토콜을 적용하여, 우리는 약의 세포 수를 계산 하였다. 1.2 × 10 ⁶ 원시 ¹⁹ F의 크기의 이미지를 기반으로.

그림 1. ¹⁹ F MRI 기반 세포 추적을위한 중요한 단계. 5)의 생체 데이터를 확증하기 위해 수행 될 수있다. 그림 허가 ⁶ 재현. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2. 주제 ¹⁹ F NMR 스펙트럼. 스펙트럼을 수득 ¹⁹ F 신호를 도시때문에이 경우 TFA의 참조의 알려진 양, 그리고 "샘플"라는 세포의 알려진 숫자에. 이는 MR 화상 데이터로부터 생체 정량 필요 셀당 불소의 양을 계산하는데 사용될 수있다.

그림 3. 물에 TFA와 튜브의 플립 각 맵은 ¹ H ¹⁹ F 채널에 인수되었다. 비례 계수가이 설정을위한 1.03 ± 0.08로 계산되었다. FA : 각도를 플립.

그림 4. 생체 내 ¹ H / ¹⁹ 배수 림프절에 원점 복귀 수지상 세포의 F 이미지. 그림 ¹⁹ F 신호 표시와 마우스의 대표 이미지를 보여줍니다,거짓 색상, 참조 (R)과 레이블이 세포. 마우스 만 다리는 여기에 몇 군데 있었다. 이 예에서, 주입 된 표지화 된 세포는 배수 림프절로 이주. 촬상 파라미터는 본문에 요약되어있다. 그림은 단지 설명을위한 것입니다.

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜은 생체 내 ¹⁹ F MRI 세포 추적을위한 일반적인 절차를 설명합니다. 기술 공동 배양 방법에도 불구하고, ¹⁹ F 에이전트와 세포를 라벨에 대한 몇 가지 다른 프로토콜이 있습니다. 그러나, 공동 배양 가장 자주 사용되며 상기 형질 제 ⁶ 첨가하여 예를 최적화 할 수있다. 실제 셀 라벨링 프로토콜은 세포 유형에 의존 할 것이다. 만 키 표시 단계는 여기에서 프로토콜에 설명되어 있습니다. 일반적으로, 레이블은 몇 시간에서 몇 일까지 선택된 시간을 준비하고 세포에 추가됩니다. 마지막으로, 세포를 화상 데이터로부터 정량화 ^3을 실시 할 것, 특히 라벨의 과잉을 제거하기 위하여주의 깊게 세정되어야한다. ¹⁹ F 에이전트 형광 태그, 외부 (아닌지에 바인딩) 라벨의 존재를 포함하는 경우 세포는 현미경을 사용하여 검출 될 수있다. 표지 후에, 세포를 연구 할 필요가있다(트리 판 블루 배제 분석에 의해 예) nonlabeled 세포 관련 생존과 기능. 이러한 수지상의 경우 T 세포를 활성화하는 기능과 같은 셀 고유 기능 테스트는 또한 수행되어야한다. 일부 ^비-19 F MRI 레이블 세포 이동 ^(18)에 영향을 마지막으로, 이러한 테스트는 특히 높은 셀 로딩 ¹⁹ F 라벨에 포함되어야한다.

동물 모델에 대한 프로토콜은 또한, 사용자의 필요에 의존한다. 그러나, 실험을 계획 할 때 ¹⁹ F MRI의 엄격한 감도 한계를 기억하는 것이 중요하다. 게시 감도 값은 10 ¹¹ -10 ^{13 19} F. 범위의 셀 로딩과, 1,000-00,000 cells/voxel/1의 시간 시간 ⁶ 범위 관심 영역의 감도와 예상 라벨 농도는 촬상 파라미터에 영향. 예를 들어, ¹⁹ F 콘텐츠 사용 슬라이스 두께는 수정 될 수있다 말해 줄 수는 ¹ H 이미지의 일치하거나 (예 : 전체 림프절 또는 하나의 슬라이스에 대한 관심의 영역으로) 훨씬 더 두꺼운 영역을 커버 할 수 있습니다. 일반적으로, F ^(19)는 촬상 고해상도 대개 림프절 같은 구조를 구별 할 필요는 없다 특히 이후의 신호 검출을 최대화하기 위해 낮은 해상도로 수행된다. 신호가 충분하면, 얇은 조각의 큰 수를 취득하고 이들로부터 산출 그 이상의 볼륨 전체 신호 할 수있다. 그러나, 최적의 매개 변수를 개별적으로 각 응용 프로그램에 대해 유도해야합니다.

우리는 케타민 / 자일 라진은 이소 플루 란과 같은 플루오르 흡입 가스를 피하는 주사 마취 프로토콜을 설명합니다. 다른 프로토콜은 문학 ^{10, 11에} 사용되었습니다. 그러나, 모든 경우에, 이러한 프로토콜은 마우스 균주, 연령, 성별, 건강 및 이미징 세션의 길이 및 주파수에 따라 조정해야한다.

"ontent> 여러 ¹⁹ F MRI 이미징 시퀀스들은 ⁶ 참조 검토를 위해, 휴대폰 추적에 사용되었다. 우리 촬상 프로토콜이 좀처럼 다른 이미징 시퀀스를 포함하도록 수정 될 수있다. 그러나, 여기에 설명 정량화 방법은 계정에 어떤 부분 부피를 차지하지 않는다 효과, ROI를 선택 불일치, 생체 내에서 라벨의 휴식 매개 변수의 변화, 또는 휴대 ¹⁹ F 부하의 변화. 이러한 문제는 다른 곳에 ^3에 설명되어 있습니다. 요약하면, 오류가 종 세포 추적을위한 허용 범위 내 것으로 밝혀졌다 ^10. 이러한 이전 작품에 비해 우리는 별도로 B1 필드를 매핑하여 표면 RF 코일의 사용을위한 화상 보정 기법을 제안한다. 특정 RF 코일 설정에 따라 그것이왔다 B1 매핑 기술의 제한 사항을 인식하는 것이 중요 . 예를 들어, 여기에 B1을 제시 이중 각 방법에 대한 ¹ H MRI ^(16)의 맥락에서 잘 공부지도에서 90 ° -180 ° ¹⁴ 이하 상당한 오류가 다른 지역에 도입 할 수 플립 각 쌍에 대한 가장 정확합니다. 그러나 체외에서 적절한 검증 한 후, 같은 회고 보정은 더 셀 정량을 향상시킬 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 적어도 초기에, 더 설립 기술과 데이터의 확증을 추천합니다. 이것은 일반적으로 큰 오류를 제외하는 데 도움이 다른 생체 내 이미징 기술, 예를 들어 광학 이미징과 함께 이루어집니다. 대부분의 경우, 조직 학적 평가를 정확하게 ¹⁹ F 라벨 위치를 평가하고 촬상 데이터와의 상관을 허용하는 것이 필요하다. 이것은 ¹⁹ F 에이전트에 형광 염료의 추가를 필요로 할 수있다.

¹⁹ F MRI 아직 임상 셀 추적에 적용되지 않았지만 마지막으로, 이는 인간의 사용이 프로토콜을 수정하는 것이 가능하다. 필요한 메인 변형 편안한 자세만큼을 수행하는 것화 및 미리 가능한 설정 (피사체가 스캐너에있는 시간의 길이를 최소화하기 위해), 임상 비 흡수율 (SAR)의 제한 내에서 유지하는 촬상 파라미터를 조정할.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec