Summary
I motsetning til cellefrie HIV-1 partikler, er smittet CD4 + T-celler effektivt avføles av plasmacytoid dendrittiske celler (PDCs). Dette manuskriptet beskriver en fremgangsmåte hvor perifere mononukleære blodceller (PBMC) eller isolerte PDCs ko-dyrket med HIV-1-infiserte T-celler til å evaluere medfødt sensing av PDCs som bedømt ved frigjøring av type I-IFN.
Abstract
HIV-1 medfødt sensing krever direkte kontakt med infiserte CD4 + T-celler med plasmacytoid dendrittiske celler (PDCs). For å studere denne prosessen protokollen beskrevet her bruker nylig isolerte humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) eller plasmacytoid dendrittiske celler (PDCs) for å avføle infeksjoner i hver T-cellelinje (MT4) eller heterologe primære CD4 + T-celler. For å sikre riktig sensing, er det viktig at PBMC blir isolert umiddelbart etter blodprøvetaking, og at optimal prosent av infiserte T-celler blir brukt. Videre kan multi-parametriske strømningscytometrisk farging anvendes for å bekrefte at PBMC-prøver inneholder de ulike celle linjene ved fysiologiske forhold. Et antall kontroller kan også bli inkludert for å vurdere levedyktigheten og funksjonen av PDCs. Disse inkluderer, tilstedeværelse av spesifikke markører overflate, vurdere cellulære responser til kjente agonist av Toll-liknende reseptorer (TLR) trasé, og bekrefter en mangel på spontaneous type I interferon (IFN) produksjon. I dette systemet nyisolerte PBMC eller PDCs ko-dyrket med HIV-1-infiserte celler i 96-brønners plater for 18 til 22 timer. Supernatanter fra disse ko-kulturer blir deretter brukt for å bestemme nivåene av bioaktive Type-I-IFN ved å overvåke aktivering av ISGF3 bane i HEK-blå IFN-a / p-celler. Før og i løpet av co-dyrkningsbetingelser, kan målceller bli utsatt for flowcytometrisk analyse for å bestemme et antall parametere, inkludert prosentandelen av infiserte celler, nivået av spesifikke markører overflate, og differensial dreping av infiserte celler. Selv om disse protokollene ble opprinnelig utviklet for å følge type I IFN produksjon, kan de potensielt brukes til å studere andre imuno-regulerende molekyler løslatt fra PDCs og å få ytterligere innsikt i de molekylære mekanismene som styrer HIV-en medfødt sensing.
Introduction
Skriver-I IFN-produserende PDCs representerer første forsvarslinje mot virusinfeksjoner, og som sådan tjene som en viktig forbindelse mellom medfødt og adaptiv immunitet 1. Mens cellefrie HIV-1 partiklene er dårlig detektert av det uspesifikke immunsystemet, er HIV-1-infiserte CD4 + T-celler effektivt avføles av PDCs 2. Følermekanismen krever en innledende kontakt mellom det virale kappe glykoprotein (gp 120) på overflaten av infiserte T-celler og CD4-molekyler på PDC-, som deretter følges av viruset fangst og internalisering av PDC. Følgende anerkjennelse av overført HIV-1 RNA ved TLR7 utløser aktiveringen av MyD88 / IRF7 sti og til slutt fører til type-I IFN produksjon 3. Viktigere, den andre følerveien til stede i PDCs, som blir mediert av TLR9, inhiberes ved interaksjonen av viral glykoprotein, gp120, med PDC-spesifikk overflatemarkør BDCA2 4.
5. BST2 blir uttrykt i høye nivåer på overflaten av PDCs og enkelte kreftceller, men ved forholdsvis lavere nivå i andre celletyper, så som B-celler, makrofager og T-celler. Viktigere, kan BST2 bli indusert av typen I-IFN i en rekke transformerte cellelinjer, så vel som i primære cellekulturer av humane og murine opprinnelse 6. Bortsett fra sin immunregulerende funksjon, ble BST2 nylig funnet å hemme frigjøringen av HIV-1 og andre innhyllet virale partikler av tverrbindingsbegynnende viruspartikler på den infiserte celleoverflate 7. I tilfellet med HIV-1, er virus-kodet protein tilbehør U (VPU) vist seg å fungere som en BST2 antagonist. Det antas at VPU nedregulerer BST2 fra celleoverflaten av HIV-1-infiserte celler, stedet for dens tjoreing aktivitet og som et resultat øker viral frigjøring og spre 7, selv om dette begrepet har blitt utfordret 8,9. I fravær av VPU, et stort antall fullstendig dannet og moden avkoms HIV-1 partiklene holdes tilbake på celleoverflaten. Hvorvidt disse tethered partiklene kunne representere effektive mål for immun sensing fortsatt et åpent spørsmål. I tillegg er det uklart om VPU kunne dysregulate type jeg IFN produksjon fra PDCs ved å modulere overflaten BST2 nivåer.
Tidlige studier som ble utført for å vurdere HIV-1 sensing ble utført ved bruk av cellefrie HIV-1 partikler som er generelt ansett dårlige indusere av typen IFN-I 3,10-12. Gitt at nylige studier antyder at PBMC og PDCs effektivt fornuft HIV-infiserte CD4 + T-lymfocytter 2,13,14, beskriver vi her en enkel metode for å måle medfødte responser utløst av PDCs ved gjenkjenning av HIV-1-infiserte celler in vitro.
Protocol
Generelle merknader
Det er viktig å holde celler i kultur uten antibiotika, ettersom til og med kontrollert bakterielle infeksjoner kan registreres av PBMC. En slik avføling av bakterielle komponenter vil fremkalle en bakgrunn interferonproduksjon som ikke kan skilles fra den utløses av spesifikke HIV-1 sensing. Videre har alle celler har til å bli rutinemessig undersøkt med hensyn til fravær av mycoplasma forurensning.
Bruk alltid endotoksin-free løsninger når det er mulig.
Strømningscytometrisk karakterisering av de forskjellige celler som skal anvendes i ko-kulturene (PBMC, PDCs, MT4 og CD4 + T-celler) er et valgfritt trinn, men anbefales siden det kan gi verdifull informasjon som er nødvendig for riktig tolkning av et gitt eksperiment.
1. Utarbeidelse av Infiserte Target Cells
- Opprettholde humane CD4 + T-cellelinje MT4 i RPMI 1640 mediet supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), referert heretter som RPMI-1640 komplett medium.
- Isolering av primære CD4 + T-celler.
- Isolere mononukleære celler fra humant perifert blod ved tetthetssentrifugering.
- Isolere CD4 + T-lymfocytter ved hjelp av en CD4 + T celler negativ seleksjon kit, etter produsentens anbefalinger.
- Aktiver CD4 + T-lymfocytter med PHA-L (5 ug / ml) i 48 timer og deretter opprettholde celler i RPMI-1640 komplett medium supplert med rekombinant IL-2 (100 U / ml). Infisere primære T-celler 5 dager etter isolasjon.
- Infeksjon av målceller (MT4 T cellelinje eller heterologe primære CD4 + T-celler).
- To dager før co-kultur, infisere T-celler med HIV-1 viruset. I det konkrete eksempelet beskrevet her pNL4.3-GFP_ires_Nef villtypen (WT) eller pNL4.3-GFP_ires_Nef delta VPU (dVpu) virus ble brukt. Disse virusstammer representerer greno fluorescerende protein (GFP) -merket isogene smittsomme molekylære kloner som skiller seg bare i sin evne til å uttrykke VPU.
- Bruk forskjellige multiplisiteter på infeksjon (Mois) og velg kulturer med tilsvarende nivåer av infeksjon for co-kulturer. Dagen for ko-kulturen, bestemme prosentandelen av GFP + celler ved flowcytometri som en markør for infeksjon. Bruk kun kulturer med et område på 20-50% infiserte celler til ko-kulturer.
Valgfritt trinn: Utfør flowcytometrisk flekker på dette punktet for å vurdere overflaten uttrykk for molekyler / ligander av interesse som BST2, og CD4. For celleoverflatefarging, resuspender 0,5 x 10 6-T-celler i 100 ul vaskeløsning, tilsett 1 pl anti-CD4_PerCP / Cy5.5 og 1 ul av anti-BST2_A660. Inkuber rørene i 45 minutter ved 4 ° C, før vasking med flowcytometri vaskeløsning. Dersom studiene er rettet mot å vurdere rollen til VPU-mediert antagonisme BST2, utføre en HIV-1 partiklerfrigjøring analyse ved dette tidspunktet som tidligere beskrevet 15.
2. Isolering og berikelse av Sensing Cells (Hele PBMCer eller beriket PDCs)
Merk: Når PBMCer brukes for sensing, starter isolasjon innen en halv time etter blodprøvetaking og gjennomføre det på en riktig måte. Bruk PBMCer umiddelbart for co-kulturer eller PDC-berikelse.
- Isolere mononukleære celler fra humant perifert blod ved tetthetssentrifugering.
Valgfritt trinn: Utføre multi-parametrisk flowcytometri flekker å bekrefte at nyisolerte PBMCer inneholde ulike celle linjene på fysiologiske forhold. For celleoverflatefarging, resuspender 10 6 PBMC i 100 ul blokkeringsløsning Fc, og inkuber i 15 min ved 4 ° C. Etter blokking, tilsett 1 mL av anti-CD3_Pacific Blå (for T-celler), 1 mL av anti-CD14-PE_Texas Red (for myeloide celler), 4 ul anti-BDCA2_APC og en ul av anti-ILT7_PE (for PDCs). Inkuberrør for 45 min ved 4 ° C, før vasking med flowcytometri vaskeløsning. - Berike PDCs med en PDC negativ seleksjon kit, etter produsentens anbefalinger. Det anbefales å jobbe raskt, holde cellene kaldt, og bruke forhåndskjølte løsninger. Dette vil hindre at tildekking av antistoffer på celleoverflaten og uspesifikke celle merking samt sikre maksimal PDC aktivitet.
- Utføre multi-parametrisk flowcytometrisk analyse av nyisolerte PDCs å bekrefte renhet, prosentandel av berikelse, og relative mengdene av PDC bestemt overflatemarkører (som ILT7 og BDCA2). For celleoverflatefarging, resuspender 10 4 PDCs i 100 ul blokkeringsløsning Fc, og inkuber i 15 min ved 4 ° C. Etter blokking, tilsett 1 mL av anti-CD3_Pacific Blå, en ul av anti-CD14_PE_Texas Red, 4 pl anti-BDCA2_APC og en ul av anti-ILT7_PE. Inkuber rørene i 45 minutter ved 4 ° C, før vasking med flowcytometri vaskeoppløsning (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). Et minimum på 40% renhet PDC anbefales (hvis utgangsmaterialet er 0,4% PDC, vil dette være ekvivalent med en 100-gangers anrikning).
3. Co-kulturen i infiserte CD4 + T-celler og Sensing Cells (Hele PBMCer eller beriket PDCs)
- Bland 220 ul av PBMC (utvannet ved 850.000 celler / ml) eller 220 ul av PDCs (ved en konsentrasjon som strekker seg fra 100 000 til 500 000 celler / ml) med 30 pl av infiserte T-celler (utvannet 10 6 celler / ml) per brønn i en U-bunn 96-brønners plate.
- Som kontroller, tallerken PBMC eller PDCs og T-celler alene. Justere volumet i tillegg til 250 ml med RPMI 1640 komplett medium.
- Vurdere cellulære responser til kjente agonist av TLR7 og TLR9 trasé. For dette formål, plate 220 ul av PBMC (fortynnet ved 850.000 celler / ml) eller 200 ul PDCs (ved en konsentrasjon som strekker seg fra 100 000 til 500 000 celler / ml) per brønn i en U-bunn 96-brønners plate og tilsett TLR7 agonist ( Imiquimod, sluttkonsentrasjon: 2,5 ug / ml) eller TLR9 agonist (ODN 2216 CpG-A, sluttkonsentrasjon: 5 uM). Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 18-22 timer og behandle dem på en måte tilsvarende co-kulturene beskrevet nedenfor.
- Inkuber co-kulturer ved 37 ° C og 5% CO 2 for 18-22 timer, og deretter overføre dem til en V-bunn 96 brønners plate. Sentrifuge i 5 min ved 400 x g.
- Overfør supernatanten til en flatbunnet 96-brønners plate. Supernatantene kan oppbevares ved -80 ° C eller anvendt for type I-IFN deteksjon umiddelbart.
- Suspender co-kultiverte celler i 2% paraformaldehyde og analysere dem ved hjelp av flowcytometri. På grunn av forskjeller i størrelse og korning, MT4-celler er lett skilles fra PBMC eller PDCs basert på deres side-scatter (SS) versus fremtids scatter (FS) profiler. Hvis primære T-celler blir anvendt som mål-infiserte celler, kan disse farges med hvilken som helst celle tracker fargestoff, slik som CSFE, før ko-kultur.
- Måling av bioaktivt type I IFN ved hjelp av HEK-Blue IFN-a / p-reporter-celler.
Merk: Disse cellene ble samlet etter stabil transfeksjon av HEK293 celler med humane STAT2 og IRF9 gener for å oppnå en fullstendig aktiv type I IFN-signalreaksjonsveien. De inneholder også utskilt alkalisk fosfatase (SEAP) reportergen under kontroll av IFN-α / p-induserbar promoter ISG54. Stimulering av disse cellene med type I-IFN aktiverer JAK / STAT / ISGF3 sti og induserer produksjon av SEAP.- Oppretthold HEK-Blue IFN-α / p-celler i DMEM supplert med 10% FBS. Plate dem ved en tetthet på 50.000 celler per brønn i en flatbunnet 96-brønners plate, i et sluttvolum på 180 ul.
- Tilsett 20 mL av ko-kultur supernatanten til hver brønn in duplo. Hver plate krever også et sett av interne standardkontroller (human IFNα, sluttkonsentrasjon fra 100 U / ml til 2500 U / ml). Inkuber platene ved 37 ° C og 5% CO2 i 18-22 Hr.
- Bestemme nivåer av alkalisk fosfatase-aktivitet ved anvendelse quanti-blå løsning, som skifter fra rosa til fiolett / blå i nærvær av enzymet. Forbered quanti-Blue følgende produsentens anbefalinger. Legg 180 ul av denne løsning til hver brønn i en flatbunnet 96-brønners plate. Til hver brønn også legge til 20 mL av de induserte HEK-Blue IFN-α / p-celler supernatanter, og inkuber platen i en 37 ° C inkubator inntil fargen utvikler seg i standard IFN-kontrollbrønner.
- Evaluere nivået av SEAP ved hjelp av et spektrofotometer ved 620 til 655 nm og bestemme konsentrasjonen av type I-IFN ved ekstrapolering fra den lineære delen av IFN standardkurven.
Representative Results
Co-kultur systemet beskrevet i Figur 1 gir et kontrollert studie av HIV-1 medfødt sensing. På grunn av den varierende art av primære celler, er det viktig at normale forhold av myeloid og T-celler (henholdsvis + CD14 og CD3 +) observeres, slik som i eksempelet vist i figur 2A. Videre er bare et lavt antall aktiverte T-celler (høyere FS og høyere CD3-nivåer sammenlignet med ikke-aktiverte T-celler) er ønskelig i de nylig isolerte PBMC kulturer. PBMC med unormale forhold mellom de ulike celletyper er ofte ute av stand til å montere en skikkelig medfødte immunrespons in vitro, sannsynligvis på grunn av en allerede aktivert fenotype som følge av en pågående infeksjon. Viktigst, må den relative prosentandelen av PDCs skal evalueres som vist i figur 2B. Selv om denne prosentandelen kan variere fra 0,2 1,2%, er en unormal sensing fenotype også observert med både extremes av denne serien. Anrikning av PDCs ved hjelp av negativ seleksjon gir ofte 50-95% PDC renhet, som vist i de to eksemplene fra i Figur 2B (92% og 72%). En prototypisk eksempel for den generelle forsøket er vist i figurene 3 og 4. I dette eksempel ble MT4-celler infisert med pNL4.3-GFP_ires_Nef WT eller trekant VPU for å oppnå 30% infeksjon ved ko-kultur (figur 3A). Som tidligere beskrevet, bare infeksjoner med WT virus resulterte i en betydelig nedregulering av overflaten BST2 (figur 3B). På grunn av sine forskjeller i størrelse og detaljnivå, kan MT4-celler være lett skilles fra PBMC av flowcytometri (Figur 4A). Etter ko-kulturen inkubasjon bare PBMC i kontakt med kjent TLR7 eller TLR9 agonist og PBMC-er i kontakt med HIV-1-infiserte celler frigis betydelige mengder av typen IFN-I (figur 4B). Ingen IFN ble påvist i PBMC alene, i PBMC-co-cultured med mock-infiserte MT4-celler, eller i infiserte MT4-celler alene (Figur 4B). I eksemplet som presenteres her, ble medfødt sensing of HIV-1-infiserte MT4-celler ved hjelp av PBMC funnet å være betydelig redusert i nærvær av VPU.
Figur 1:. Skjematisk oversikt over eksperimentell design SUP: supernatant Klikk her for å se større bilde.
Figur 2: Fenotypisk karakterisering av nyisolerte PBMC og enriched PDCs. (A) Normal fordeling av myeloide celler og T-celler observert i PBMC isolert fra en frisk donor (Prosent av myeloide celler bør ligge mellom 10-20% og T-cellene mellom 55-65%). PBMCer prøven ble farget med fluoroforen-konjugert antistoff som gjenkjenner overflate CD14 (myeloid avstamning markør) og CD3 (T-cellemarkør). (B) Fenotypisk karakterisering av PDCs. Før berikelse PDCs utgjør mellom 0,2 til 1,2% av det totale antall celler i løpet av de PBMC (0,99% i det viste eksempel). Disse cellene kan bli identifisert basert på ekspresjon av spesifikke markører, slik som BDCA2 og ILT7, tilstede på celleoverflaten. Negativ seleksjon kan anvendes for å berike betydelig antall PDCs og eliminere potensielt skadelige forurensninger, slik som CD14 + myeloide celler (anrikning nådde 92% og 72% i de to eksemplene vist). CLIck her for å se større bilde.
Fig. 3: Karakterisering av HIV-1-infiserte mål-MT4-celler (A) Prosent av infiserte celler i løpet av de MT4 kulturene infisert med pNL4.3-GFP_ires_Nef WT eller dVpu som bestemmes av prosentandelen av positive celler GFP. (B) BST2 celleoverflaten uttrykk i de infiserte celler ble evaluert etter overflaten flekker. De grå fylt histogram representerer mock-infiserte celler farget med pre-immune kaninserum (unstained kontroll); de resterende histogrammer representerer celler farget med anti-BST2 polyklonalt kaninserum. Histogrammer med heltrukne linjer representerer kontroll GFP negative (neg) celler; mens histogrammer med stiplede linjer tilsvarer infiserte GFP positive (POS) celler. Mener influensaorescence intensitet (MFI) verdier er angitt for hver prøve. Flowcytometri ble utført og analysert som beskrevet i figur 2. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4:. Co kultur nyisolerte PBMC og infiserte MT4 T-celler (A) Sammenligning av flowcytometri FS / SS profiler observert for MT4 T-celler alene, PBMC alene, eller co-kulturer mellom PBMC og MT4 T-celler. På grunn av forskjeller i størrelse og detaljnivå, kan MT4 T-celler være lett skilles fra PBMC i co-kulturer som bruker flowcytometri. (B) representativt eksempel av mengden av type I-IFN frigitt etter stimulering av PBMC med TLR7 eller TLR9 agonist (siden), eller etter co-kulturer med uekte eller de angitte MT4-celler infisert med pNL4.3-GFP_ires_Nef WT eller dVpu. Rådata vist som OD 650 verdier og deres tilhørende converseion å skrive-I IFN konsentrasjon uttrykt i U / ml. Klikk her for å se større bilde.
Discussion
Protokollen beskrevet her måle avføling av T-celler infisert med GFP-merket HIV-1-virus som bare er forskjellige i deres evne til å uttrykke VPU, som beskrevet i vår nylig rapport 18. Imidlertid kan disse metodene lett modifiseres for å studere avføling av ukodede virus, så vel som andre virus som mangler virusgener som potensielt kan modulere medfødt sensing. Dersom virusene som brukes ikke uttrykker GFP, bør prosentandelen av infiserte målceller bestemmes på annen måte før ko-kultur, som P24 (kapsid) intracellulær farging og flowcytometri eller p24 ELISA. Videre kan disse protokollene brukes med forskjellige target T-celler, inkludert en rekke tilgjengelige cellelinjer og primære celler.
Metodene som beskrives i dette manuskriptet har en rekke fordeler sammenlignet med tidligere metoder som brukes til å studere HIV-1 sensing. Først og fremst har det blitt fastslått av en rekke grupper som cellefrie HIV-1 partiklene er dårlige indusere av type I IFN 2,13,14. Videre tidlige studier avhengig av eldre IFNα ELISA-baserte metoder for å kvantifisere mengden av type I-IFN produsert. En begrensning av denne påvisning teknikken er at de fleste av de eldre IFNα ELISA kits bare måler én type IFNα, mens over andre typer IFNα og IFNβ. Anvendelsen av de beskrevne reporter cellelinjene overvinner denne begrensning som konsentrasjonen av alle bioaktive former av human type I-IFN-kan måles samtidig. Teknikken er svært følsom, mindre kostbart enn den nye generasjonen av IFN ELISA kit og for mange donorer store mengder av typen IFN-I kan lett oppdages. Likevel kan denne protokollen kan lett tilpasses for bruk med andre type-I IFN avlesningsmetoder så som ELISA.
Kritiske trinn: Det er viktig at kvaliteten på alle cellulære komponenter (begge målene og effekt) bli kontrollert. Potensiell forurensning, selv når asymptiske, må overvåkes og kontrolleres. Som vi tidligere nevnt, antibiotika styrt asymptomatisk bakteriell forurensning, og potensielt andre intracellulære patogener, slik som mykoplasma, kan generere tilsvarende immunresponser overfor de som ble observert etter HIV-1-infeksjon, det vil si produksjon av type I-IFN. Dessuten, alle reagenser må være fri for LPS eller andre potensielle endotoksiner. Tilsvarende er overvåking av PBMC og PDCs også viktig siden humane prøver kan ofte være primet med underliggende pågående infeksjoner, som kan påvirke normal sensing. Vi anbefaler alltid inkludert den foreslåtte negative kontroller, for eksempel fravær av målceller samt co-kulturer med mock-infiserte celler. Levedyktigheten av infiserte celler er også viktig for riktig PDC sensing siden Type-I IFN ikke fremstilles ved samtidig kultur med apoptotiske celler 2,14.
En viktig begrensning av teknikken er behovet for nylig isolerte primære celler. Denne fremgangsmåten var ikketestet ved hjelp av PBMC eller PDCs som enten tidligere ble frosset eller holdes i kultur. Isoleringen av PBMC-er arbeidskrevende, og disse celler har en meget begrenset levetid. Videre bør standardprotokoller for å beskytte mot blodbårne patogen brukes mens du arbeider med menneskeblod. Det er ofte flere kilder til variabilitet i forbindelse med arbeid som involverer nylig isolerte humane celler. Blant dem er de forskjellige prosedyrer som er implementert for å isolere disse cellene, og den arvede variabilitet oppstått fra donor til donor. Selv om det er umulig å unngå variabilitet mellom donor, bruken av de foreslåtte positive kontroller, for eksempel måling av respons på kjente agonister av TLR7 og TLR9 trasé, vil gi et viktig intern kontroll for disse eksperimentene. Vi har observert at en robust respons til agonister av TLR9 veien kan bli korrelert med en sunn PDC respons, mens en responsive TLR7 bane er nødvendig for en riktig respons mot HIV-1 3.
2, anrikning av PDCs fra PBMC er ofte ikke nødvendig. Imidlertid, hvis den eksperimentelle design krever den (for eksempel i sammenheng hvor uttømming av spesifikke PDC overflatemarkører er nødvendig) negativ seleksjon er å foretrekke fremfor positiv utvelgelse, som celler forblir fri for antistoff etter utvelgelsesprosessen. Isolerte PDCs gjennomgå raske apoptose i kultur. For forsøk som krever disse cellene som skal dyrkes i lengre tid, kan dyrkningsmedier suppleres med IL-3. Dette cytokin induserer PDC spredning og hemmer apoptose 16. Imidlertid må IL-3-bruk for å bli kontrollert, siden det kan føre til PDC modning eller differensiering.
Metoden som beskrives her kombinerer target HIV-1-infiserte celler med nyisolerte PBMCer eller PDCs for å gjenskape de første trinnene involvert i medfødt sensing. Denne metoden vil utvilsomt være nyttig å utforskae tidlige medfødte immun hendelser assosiert med HIV-infeksjon. Selv om de tilhørende protokollene er rettet mot å måle type I IFN, kunne de lett bli endret for å måle andre bioaktive molekyler løslatt fra PDCs på anerkjennelse av infiserte celler. Disse kan omfatte: type-III IFN (IFN-λ), pro-inflammatoriske cytokiner (så som TNF-α og IL-6) og kjemokiner CXCL10, CCI4, og CCL5 17.
Acknowledgments
Vi takker E. Massicotte og J. Herren for sakkyndig teknisk assistanse under flowcytometri og celle sortering eksperimenter. Dessuten ønsker vi å takke IRCM klinikken ansatte og alle givere for å gi blodprøver. Perifere blodprøver ble innhentet fra voksne, friske givere som ga skriftlig informert samtykke i samsvar med Helsinkideklarasjonen henhold forskning protokoller godkjent av forskningsetisk vurdering styret av Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Følgende reagenser ble oppnådd gjennom NIH AIDS Reagens Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT4-celler fra Dr. Douglas Richman; og menneske rIL-2 fra Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.
Dr. Cohen er mottaker av Canada Research Chair i Human Retrovirology. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra CIHR (CIHR 111226) Dr. Cohen og fra Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) AIDS nettverket til Dr. Bego og Dr. Cohen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
| HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
| RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| FBS | Wisent | 080-150 | |
| Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
| CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
| Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
| PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
| Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. |
| Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
| ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
| Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
| QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
| Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
| Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
| 10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
| 10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
| 10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
| 2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
| anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
| anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
| anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
| anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
| anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
| anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |
References
- Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J.
- Lepelley, A., et al.
- Beignon, A. S., et al. Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions. The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).
- Martinelli, E., et al. HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).
- Cao, W., et al. Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction. The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).
- Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling. Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).
- McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions. PLoS pathogens. 9, e1003299 (2013).
- Manel, N., et al. A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells. Nature. 467, 214-217 (2010).
- Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1. Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).
- Fonteneau, J. F., et al. Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells. Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).
- Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids. Virology. 221, 113-119 (1996).
- Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration. Virology. 343, 256-266 (2005).
- Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin. Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).
- Grouard, G., et al. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).
- Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance. Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).
- Bego MG,, Côté, É, Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. Cohen ÉA. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11 (7), e1005024 (2015).
