Introduction
Att kunna identifiera och kvantifiera proteinexpressionsnivåer är en standardteknik för djur- och cellbaserade experiment. Trots ett långvarigt intresse för tidig embryonal hjärtklaff utveckling, utvärdering proteinuttryck i detta specifika vävnad under utveckling är för närvarande begränsad till immunhistokemi i både brud och mus 1,2. En del av svårigheten att kvantifiera proteinuttryck i utvecklings ventiler av de flesta modellorganismer (t.ex. chick och mus) är den lilla storleken av ventilerna, vilket begränsar den mängd protein som kan erhållas. Således, för kvantitativa analyser, forskare grundar sig oftast på RNA-extraktion och amplifiering för efterföljande kvantitativ PCR eller microarray analys 2-5. Men RNA och proteinexpressionsnivåer inte är helt korrelat 6, så fokusera på RNA-uttryck kan inte ge en rigorös beakta de många förändringar som sker i en viss signaleringväg vid olika tidpunkter under utvecklingen. Baserat på denna gräns i tillgängliga metoden, var målet för den här proceduren för att utveckla ett protokoll för tillförlitligt erhålla tillräckliga mängder protein från utvecklings embryonala mus hjärtklaffregioner för kvantitativ analys av förändringar som sker i olika signalvägar som är viktiga i mognaden av denna vävnad.
Embryonala ventiler är redan allmänt dissekeras från möss för RNA-isolering och efterföljande genuttrycksanalys 2-5. Emellertid har dessa studier varit begränsad till att använda genuttryck som en avläsning av signalväg aktivering, som inte tillåter att upptäcka upptäcka posttranslationprotein modifieringar som kan påverka nedströms signalering. Använda RNA isoleringstekniker som utgångspunkt började vi med att dissekera de områden av intresse. Eftersom vårt intresse var att upptäcka fosforylerade proteiner som var vägledande för signalering patHway aktivitet under en viss period av aortaklaffen utveckling (E13.5-14.5) utförde vi alla dissektioner i fosfatfria Tris-buffert och samlas ventilerna i en Tris-baserad lysbuffert med fosfatas och proteashämmare. I vårt speciella fall endast aortaklaffen regioner uppsamlades, men pulmonalisventil regionen kunde enkelt erhållas samtidigt. Ventil regioner homogeniserades sedan och kombinerades med en provbuffert som för närvarande används för att studera proteinuttryck i vuxna hjärtklaffar 7. Genom att använda små provvolymer (t.ex. 2 pl) och samla ventil regioner från embryon med samma genotyp, kunde vi upptäcka fosforylerade och nonphosphorylated proteiner på embryonala dag 13,5 8. Eftersom ventil regioner kan frysas och lagras i lysbuffert, kan embryona genotypas om det behövs före sammanslagning.
Denna teknik breddar uppsättning verktyg som är tillgängliga för utvärdering av cell signaling vägar under utveckling och ger ett kvantitativt komplement till immunohistokemi, speciellt för utvecklingshjärtklaffar. Denna teknik bör vara till nytta inte bara för utvecklings kardiologer utan även alla utvecklingsbiologer som arbetar med embryon i tidiga skeden är intresserade av områden som innehåller begränsade vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla experiment har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of North Carolina i Chapel Hill.
1. Punktaortaklaffen
- Genom att använda en godkänd dödshjälp teknik för fosterstadiet av intresse, avliva en gravid mus med valpar på önskad embryonala dag (E) i utvecklingen.
- Använd 70% etanol för att sterilisera buken av den gravida kvinnan. Lyft huden och musklerna i nedre delen av magen upp och bort från de inre organen, och dissekera öppna honans nedre bukhålan för att tillåta åtkomst till livmoderhornet.
- För att hämta livmoderhornet, hålla livmoderhalsen med pincett och försiktigt skära kaudalt tången. Lyft livmoderhornet, skära av alla bindväv som håller hornet på plats och slutföra borttagningen genom att skära korsningen av livmoderhornet med äggledaren.
- Placera dissekerade livmoderhornet i en petriskål med cold 0,1 M Tris-buffert (pH 7,6) och skölj efter behov. Sedan skär livmoderhornet öppet på längden för att exponera de embryonala säckar.
- För att exponera embryot, klipp upp en embryonal sac vid korsningen av moderkakan och embryot och klippa navel fartyg att befria embryot. Placera dissekerades embryo i en andra petriskål med kall 0,1 M Tris-buffert. Återgå till det första petriskål med de återstående undissected embryon till is tills redo för nästa embryot.
- För att förbättra bröstkorgen tillgång inom embryot, halshugga embryot. Om genotypning är nödvändigt, ta bort och spara en extra vävnadsstycke i ett Eppendorf-rör placeras på is.
- Placera embryot på rygg, och skär bröstkorgsväggen lodrätt längs sidan av bröstkorgen, nära ett framben, och horisontellt över diafragman för att visualisera hjärtat. Öppna sedan bröstkorgen att exponera hjärtat.
- Använd pincett för att hålla hög längs de stora fartygen, lyft hjärtat med pincett och skär fartygen nedan. Denn, klippa ovanför pincett för att befria hjärtat. Om lungkärlen förblir oklippt, kan lungorna avlägsnas med hjärtat och bör tas bort innan du fortsätter.
- Klipp och avlägsna lungartär ovanför nivån för ventilen; på embryonala stadier som beskrivs här, är lungartären nästan genomskinlig, som stöd i sin diskriminering från ventilområdet. Klipp strax under pulmonell ventil, undvika trabeculated kammarhjärtmuskeln och samla så beskrivs i steg 1.10 om denna region är också av intresse. Här och i nästa steg, använd kapillärkraften att dra överskott Tris-buffert från regionen av intresse innan samla in lysbuffert.
- Ta försiktigt bort aortan distalt till aortaklaffen, strax ovanför nivån för ventilen; som lungpulsådern, aorta förblir något ogenomskinlig vid dessa embryonala stadier, medhjälp i dess avlägsnande. Klipp strax under aortaklaffen, återigen undvika trabeculated kammarhjärtmuskeln, och för överventil med pincett till ett Eppendorf-rör med 2 | il lysbuffert (som beskrivs i tabell Material) innehållande proteas och fosfatasinhibitorer på is.
- Upprepa steg från 1,6 till 1,10 tills ventilerna har ut från alla embryon, samla varje ventil i ett separat Eppendorf-rör. Om alla embryon har samma genotyp, kan alla ventiler skall samlas i en enda Eppendorf-rör.
- Om genotypning ska utföras för att avgöra vilka ventiler för att sammanföra, omedelbart placera prover i lyseringsbuffert vid -80 ° C fram till användning. Prover kan sedan slås samman efter genotypning (steg 2.1.1).
2. Protein Extraction
- Tina insamlade vävnaderna på is och centrifugera vid 13.100 xg under 1 min för att samla in de vävnader i lysbuffert vid botten av röret.
- Om embryon genotypanalyserades, använd en pipett för att försiktigt samla in och pool lysbuffert innehållande ventil regioner embryon med liknande genotyper. För att säkerställa en stark boch samla 3-4 ventil regioner från E13.5 embryon per prov rekommenderas.
- Om alla embryon var av samma genotyp och alla ventil regioner uppsamlades tillsammans i steg 1,10, lysera hela provet, såsom beskrivs i steg 2,2.
- Kontrollera volymen av den resulterande sammanslagna provet och till lysbuffert till en total volym av 40 ul; sedan, störa och homogenisera prover med 5 mm pärlor rostfritt stål i Eppendorf-rör. Manövrera Lysér för 2-4 minuter vid 50 Hz, enligt tillverkarens instruktioner. Spin rören kortfattat, (~ 13.100 xg under 1 min), och överföra prover till nya rör, lämnar bakom olösliga skräp.
- Förbered och separata prover för SDS-PAGE och överföring för efterföljande western blot-analys, efter ett protokoll som Eslami et al 9. Läsk för en laststyrning protein är viktigt för protein kvantifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta preparat teknik, kunde vi upptäcka fosforyleras Smad 1,5,8 (pSmad) i enkla aortaklaff regioner från E13.5 embryon. Såsom visas i figur 1A, är tillräcklig för att detektera en svag pSmad bandet proteinet som isolerats från en enda ventil regionen. Signalnivån ökar proportionellt med antalet ventil regioner som slås samman. Viktigt är att pSmad / β-aktin talet fortfarande nästan konstant i de olika urvalsstorlekar (Figur 1C). På grund av de låga nivåer av protein som finns, kan samma blot inte skalas och reprobed för total Smad. Visar dock en separat blot visar totalt Smad 1 och β-aktin samma uttrycksmönster (Figur 1B).
Dessa ventil regioner är nästan helt saknar kontaminekammarhjärtmuskeln. Med hjälp av detta preparat teknik i kombination med prover av höger kammare, kunde vi inte upptäcka ventricular myokardium markör ANP i aortaklaff regionerna, medan denna markör var lätt detekteras i ventrikeln (Figur 2). Vidare är den ventrikulära hjärtmuskelmarkör myosin lätt kedja 2V också lätt detekteras i den ventrikulära provet men är knappt detekterbar i aortaklaffen regioner. Dessa resultat stöder hur detaljerade dissektion.
Figur 1 Smad fosforylering i embryonala aortaklaffregioner. Prover beredda med allt fler sammanslagna embryonala mus aortaklaffen områden, allt från 1 till 4 ventil regioner per prov. Varje prov innehåller alla proteiner isolerade från hela ventil region (er) i en total volym av 25-28 | il. Beredda vävnader utsattes sedan för western blot-analys för fosforylerat Smad1,5,8 (pSmad) (A), Totalt Smad1 (C) och β-aktin (A, C). Protein detekterades med hjälp Lumigen ECL Ultra och avbildas med UVM VisionWorks programvara. Bandet intensitet pSmad och β-aktin är proportionell mot den mängd utgångsmaterial, som kvantifieras i (B) med ImageJ programvara. De data som presenteras är medelvärdet och standardavvikelsen för två separata blöts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Aortaklafförändringar regioner uttrycker inte kammarhjärtmuskeln markörer. Prover beredda med allt fler sammanslagna embryonala mus aortaklaffen områden, allt från 1 till 4 ventil regioner per prov, eller med enprov av den högra ventrikeln. Prover bearbetades såsom beskrivs i figur 1 och blottades för kammar myokardiet Märkning ANP (A) och myosin lätt kedja (MLC) -2V (B). ANP är helt begränsad till kammarprov och MLC-2v uttrycks på extremt låga nivåer jämfört med kammarprov. β-aktin visas som en laddningskontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att kvantifiera proteinnivåer i tidig embryonal mus och chick hjärtklaffregioner ger ytterligare ett verktyg för att förstå de kritiska cellulära signalerings händelser för ventilutveckling. Vår protokoll beskrivs här skiljer sig inte mycket från vanliga proteinisoleringsförfaranden. Men genom att ändra några viktiga steg, vi har framgångsrikt fått fosforylerade proteiner från extremt små provstorlekar. För att uppnå detta resultat, följande steg är av särskild betydelse. För att säkerställa att kvalitet protein erhålls, är det viktigt att hålla prover kylda, vare sig på is eller med iskalla buffertar, i närvaro av proteas och, om nödvändigt, fosfatasinhibitorer. Vidare är nödvändig för adekvat störa cellmembranen homogenisering med en enhet som är utformad för att behandla små provvolymer. Även med dessa försiktighetsåtgärder kan det erhållna utbytet av protein vara alltför låg för att detektera via Bradford-analysen med en spektrofotometereller ett protein kvantifiering kit och ändå ha prov för efterföljande analyser. Vi kunde fastställa att varje aortaklaffen region innehåller cirka 1 pg av protein genom att samla 7 aortaklaff regioner och använda hela provet för kvantifiering. Trots denna begränsning är tillräckligt protein erhålls för att upptäcka fosforylerade och icke-fosforylerade proteiner, även om bristen på förhands kvantifiering gör en laddningskontroll viktigt. Vi utnyttjas specifikt β-aktin eftersom det är en rik förekomst protein, som tillät oss att upptäcka det även efter strippmembran flera gånger; dess molekylvikt skiljer sig från våra proteiner av intresse; och det är ubiquitously uttrycks. En studie western blot med olika antal samlingsprov rekommenderas att fastställa hur många vävnader skall poolas för antingen embryonala hjärtklaff regioner på andra stadier av utveckling eller för andra små vävnader av intresse. Dessutom rekommenderar vi att samla minst tre tonemissions prov för varje proteinprov för att redovisa variationer i storleken av de dissekerade vävnader samt i den tidslängd varje embryo satt på is före dissektion. Om proteinet av intresse inte kan upptäckas via Western blot även efter sammanslagning prover, rekommenderar vi att minska provvolym och öka homogenisering tid att se till att alla potentiella protein är tillgängliga för detektion. Dessutom kan proteashämmare också läggas till iskall Tris-buffert under dissektioner för instabila eller lätt bryts ned proteiner. Om proteinet av intresse uttrycks på låga nivåer, ytterligare felsöknings under western blot delen av experimentet, till exempel justering av primär antikropp inkubation eller substratdetektionsmetoden, kan hjälpa till med visualisering.
Om bevisningen (t.ex. immunohistokemi eller in situ hybridisering) antyder att ett protein av intresse uttrycks både i hjärtklaffar och surrouENDE hjärtmuskeln, kan aorta eller lungartären hjärtmuskeln bli retad isär försiktigt med volfram nålar, även från ventiler från E12.5 embryon 5. Eftersom detta ytterligare steg kommer att förlänga tiden för dissekering och addera betydande tekniska svårigheter, föreslår vi att anställa den som bara behövs. I vår ursprungliga studien började vi med en immunhistokemisk analys som visade att Smad fosforylering endast ändrades i ventil mesenkymet; alltså, vi var övertygade om att eventuella skillnader som observerats genom western blot berodde på förändringar i uttryck i ventil mesenkymet 8. Vidare, eftersom utvecklings utflöde ventiler sitter vid korsningen av de stora artärerna och ventriklarna, utför en kontroll blot för förorening kammar med hjälp av en kammarhjärtmuskeln-specifik antikropp som ANP eller MLC-2v rekommenderas.
Eftersom ventilerna genomgår dramatiska omorganisation under deras utveckling, erbjuder vi följande skede specifika rEKOMMENDATIONER för kuddar / ventiler och deras omgivande vävnad. För de tidiga kuddarna (E9.5-11.5), båda utflöde och atrioventrikulär dynor enkelt visualiseras och dissekeras på grund av genomskinlighet i hjärtmuskulaturen 10; Men dessa embryon är små, och dissekera nålar rekommenderas istället för pincett och microscissors. För mellanstadiet differentiering (E12.5-14.5) 10, de semilunarklaffarna (dvs aorta och lungartär ventiler) kommer att vara mer lättillgänglig än atrioventrikulär ventiler (dvs, mitralis och trikuspidalisklaffar). Dock måste de semilunarklaffarna noggrant dissekeras eftersom aorta och lungartären är septating och rotera under denna tidsram 11,12. Noggrann uppmärksamhet bör ägnas rotation av basen av aorta och lungartären, och mittpunkten mellan dessa artärer bör konsekvent identifieras. I senare skeden av ventil mognad och kondens (E15.5 och senare) 10 kan mitralis och trikuspidalisklaffar bli retad bort inifrån ventriklarna; bör dock semilunarklaffarna vara mer lättillgänglig.
Western blot-analys är en långvarig teknik för att kvantifiera proteinexpressionsnivåer i vuxna hjärtklaffar 13, där biopsistorleken är stor. Däremot har de gratis tidiga embryonala analyser inriktade på antingen icke-kvantitativ immunohistokemi för att upptäcka proteinuttryck eller back transkription PCR, där de små utgångsbeloppet isolerade mRNA kan förstärkas före analys. Dessa för närvarande använda tekniker ge viss relevant information om förändringar i signalering och genuttryck, men saknar förmågan att kvantitativt bedöma proteinnivåer. Med det här protokollet kan vi nu lägga till kvantitativa proteinexpressionsdata till korrelerar med den kvantitativa mRNA-uttryck uppgifter och immunhistokemiska analyser.
Detta protokoll komplimanger etablerade metoder för att isolera mRNA från embryonala hjärtklaffar och bildbehandling proteinuttryck. Som sådan kommer att kombinera dessa tekniker möjliggör mer kompletta analyser av upp-och nedreglering av signalvägar, från mRNA till posttranslationella proteinmodifiering. Vidare medger denna teknik för kvantifiering av proteinuttryck, vilket kommer att öka för närvarande utnyttjas immunohistokemi tekniker. Tillsammans tror vi att denna teknik kommer att vara av intresse för alla forskare är intresserade av hjärtklaffar eller förbereder andra särskilt små vävnadsexplantat för kvantitativ western blot-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
