Summary
כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.
Abstract
כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס במוח המכרסם באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו שומרת על המורפולוגיה הטופוגרפית האופיינית של ההיפוקמפוס, ובמקביל לאפשר יישום ישיר של סוכנים תרופתיים לgyrus המשונן בהיפוקמפוס הפיתוח. בנוסף, יכולה להישמר תרבויות פרוסה לתקופה של עד 4 שבועות ובכך, לאפשר אחד כדי ללמוד את תהליך ההבשלה של תאי עצב גרגר יילוד. תרבויות פרוסה לאפשר מניפולציה תרופתית יעילה של פרוסות בהיפוקמפוס ואילו בניכוי משתנים מורכבים כגון אי ודאויות הקשורות למיקום האנטומי העמוק של ההיפוקמפוס, כמו גם את מחסום דם המוח. מסיבות אלה, אנו מבקשים לייעל את התרבויות פרוסה organotypic במיוחד עבור מחקר neurogenesis לאחר לידה.
Protocol
הערה: כל נהלי בעלי החיים תאמו את הנחיות בריאות ורווחת בעלי החיים של החוג לרפואה באוניברסיטת טורונטו.
1. הכנת Slices בהיפוקמפוס
- לעקר את המכשירים הבאים באמצעות החיטוי היבש ב 125 ° C: ידית אזמל (# 3) (2), מלקחיים דפוס רגילים, (1), מספריים מבתר קטנים גדולים (זווית לצד) (1), כפית מיקרו (כף ושטוחה קצות מרית) (1), מיקרו-מריות (מעוגלות ומעוגלות קצוות מחודדים) (2), מכחול דק (1), אש מלוטשת פיפטה פסטר (2), ריבועי גזה, 2 x 2 אינץ '(5).
- כאשר סטרילי, לשים את המכשירים למכל סטרילי ולשמור מכוסה עד לשימוש. מייד לפני הנתיחה, לטבול את הכלים בפתרון אתנול 70%.
- הכן צלחת תרבות 6 היטב עם להכניס את התרבות לפני תחילת הליך הנתיחה על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום התרבות / טוב ואחסון הצלחת בחממה ב 35 ° Cnd 5% CO 2.
2. מסדרים כלים Dissection בשכונת סטרילי זרימה למינרית
- לרסס את הזרימה למינרית עם אתנול 70% ולהסיר מכשירי נתיחה מעוקרות מאלכוהול. לאפשר למכשירים לייבוש בזמן מנוחה בצלחת פטרי סטרילי כדי למנוע מגע בין האלכוהול ורקמת המוח גזור.
- הפקדה 5-7 מיליליטר של תמיסה לנתח קר כקרח מעוקר ב 2 צלחות פטרי סטרילי גדולות. מנה אחת תהיה להירגע ולנקות את הראש (מלוכלך), והשני לקירור ושטיפת המוח גרף החוצה (הנקי). מניחים נייר סינון מעוקר באחד מהמכסים בצלחת פטרי ללנתח את המוח.
- מניחים נייר קטן, מעוקר מסנן באחד ממכסת צלחת פטרי הקטנה ללנתח את ההיפוקמפוס. הפקדה 3-5 מיליליטר של תמיסה לנתח קר כקרח מעוקר ב 2 מנות קטנות, סטרילי פטרי. צלחת אחת תחזיק היפוקמפוס גרף החוצה, אחד יחזיק חלקים בהפרדת סעיפים בהיפוקמפוסתחת מיקרוסקופ לנתיחה.
- הכן את מסוק הרקמה ידי מקליטה פיסת נייר סינון מעוקר לשלב הגזירה והרכבת סכין גילוח סטרילי. להרטיב את נייר הסינון עם פתרון לנתח מעוקר.
- תרסיס ביו-שקית נקייה עם אלכוהול ולמקם אותו בספסל נקי זרימה למינרית.
3. בהיפוקמפוס Dissection
- לרסס את גור החולדה P7 ספראג Dawley עם אתנול 70% מחוץ לספסל הנקי הזרימה למינרית ולערוף במהירות את בעל החיים באמצעות מספריים ניתוח סטרילי גדולים בתוך הזרימה למינרית הספסל. בואו ראש טיפה לפתרון לנתח קר כקרח באחד מצלחות פטרי.
- בצלחת פטרי, לשטוף את הדם ובמהירות להעביר את הראש לנייר סינון מעוקר, בצד הגחון למטה.
- באמצעות האזמל, לחתוך לאורך המשטח הגבי במטוס sagittal לחשוף את הגולגולת הבסיסית. חותך דרך העור, אך לא את עצם הבסיס, שהוא רך וקלות חדירה בחולדות של tבגילו. מניח בצד אזמל "מלוכלך" זה ולא להשתמש ברקמת המוח.
- בעזרת המספריים הקטנים המבתר (זווית לצד) ומלקחיים, לחתוך פתוחים הגולגולת לאורך תפר sagittal של הגולגולת לגבחת, הנקודה אנטומיים בגולגולת שבו תפר העטרה הוא הצטלבה בניצב על ידי תפר sagittal. שימוש במלקחיים כדי למשוך דשי גולגולת ומן קו האמצע של הגולגולת.
- הנח את כף מיקרו על החלק התחתון של המוח, מתחת לגזע המוח, כדי להרים בעדינות את המוח מהגולגולת. הרם את המוח כדי לחשוף את עצבי הראייה ונורת חוש הריח על פני השטח בסיס של מוח. חותך את המבנים האלה עם מספריים קטנים כדי לנתק את המוח באופן מלא מגולגולת. הסר ולהעביר את המוח שלם לצלחת פטרי הגדולה האחרות המכילה פתרון לנתח קר כקרח.
- שימוש בכפית מיקרו, להעביר את המוח למכסה צלחת פטרי קטן המכיל נייר סינון סטרילי. עם פיפטה פסטר סטרילי, יש לשטוף את המוח עם כמה טיפות של דיסsecting פתרון כדי לשמור על רקמה לחה.
- באמצעות סכין "נקי" אזמל לחתוך שתי ההמיספרות בנפרד. העבר את האונה השמאלית חזרה לצלחת פטרי גדולה עם כפית מיקרו ומניח את צד פיא חצי כדור למטה בפתרון לנתח קר כקרח לשימוש מאוחר יותר.
- הצג את הפנים המדיאלי של האונה הימנית ולזהות את fornix הקצה, להקה בולטת של חומר לבן בשולי המדיאלי של ההיפוקמפוס. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך sagittal דרך fornix, אבל דואג כי רק 0.5 סנטימטר של קצה האזמל יהיה מספיק כדי לחתוך את fornix.
- באמצעות 2 מיקרו-מריות, להסיר את ההיפוקמפוס הראשון מאונה ימנית על ידי הנחת יד-המרית ממש על גזע המוח והרמת הקליפה שמעליה עם יד שמאל המרית. רם בעדינות את הקליפה כדי לחשוף את החדר לרוחב ושטח המדיאלי של ההיפוקמפוס. קו מעוגל לבן, fimbria, צריך עכשיו להיות גלוי.
- יישר את העקמומיות של מרית עם Curvaטבעה של fimbria ולוחץ בעדינות המרית תחת fimbria. החלק את המרית עזבה ולרכב לאורך ציר מקורי, זנב ולאחר מכן הרם מרית בכיוון גב כדי להסיר היפוקמפוס.
- העבר את ההיפוקמפוס לצלחת 2 nd קטן פטרי עם פתרון לנתח קר כקרח. חזור על אותו ההליך באונה השמאלית כדי להסיר את ההיפוקמפוס השמאלי.
- בעזרת מרית מיקרו, להעביר בזהירות את hippocampi לבמה מסוק רקמות. מסדרים אותם צמודים ומקביל זה לזה וניצב לציר של להב המסוק. להשתמש במכחול כדי למקם את הרקמה ולהוסיף כמה טיפות של התמיסה לנתח על גבי hippocampi.
- חותכים את הרקמה ב400 מיקרומטר פרוסות בלי לעצור ולהסיר פרוסות בודדות (בדרך כלל הם לא ידבקו ללהב). אחרי כל ההיפוקמפוס נחתך, להשתמש במכחול כדי להעביר בעדינות את החלקים למנת 2 nd קטן פטרי עם פתרון לנתיחה.
- תחת מודעהissecting מיקרוסקופ, להפריד בזהירות את הפרוסות צף באמצעות amicro-מרית ומכחול.
- הסר את צלחת התרבות מוכנה מראש עם להכניס את התרבות מן החממה והמקום בזרימה למינרית.
- בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת, לצייר 4-5 פרוסות לפרוסות פיפטה והעברה למשטח הפסגה של קרום להכניס את התרבות. בשלב הבא, להתאים את המיקום עם מכחול ולהשאיר רווח בין חלקים בודדים והגבול של להכניס את התרבות.
- בעזרת פיפטה פסטר סטרילי, להסיר את הפתרון לנתח העודף ממשטח הפסגה של קרום.
הערה: בעוד הסרת להימנע פתרון ציור סעיפי רקמות לתוך פיפטה. לחלופין, להשתמש פיפטה רגילה (P200 או P1000) עם טיפים פיפטה מעוקרים כדי להסיר פתרון לאט. - מניחים את צלחת התרבות עם מדיום סרום המכיל תרבות והפרוסות בהיפוקמפוס בחזרה לתוך החממה ב 35 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
הערה: אם שיחות ניסויליצירת תרבויות מבעלי חיים רבים, לנקות ביסודיות את הספסל נקי הזרימה למינרית בין ניתוחים. חזור מכשירים לפתרון אלכוהול ולהחליף את כל פטרי-מנות, ניירות לסנן וסכיני גילוח סטרילי לפני לנתיחה שנייה.
4. האכלה ושמירת Organotypic Slices
- תרבויות Feed בספסל נקי זרימה למינרית סטרילי.
- בצע את ההאכלה הראשונה של הסעיפים בתרבית 2 ימים לאחר נתיחה. מדיום תרבות הישנה לשאוב באמצעות פיפטה זכוכית מעוקרת.
- השתמש 5 מיליליטר סטרילי פיפטה סרולוגיות להוסיף 1 מיליליטר של מדיום חדש, סטרילי, סרום המכיל את הבארות.
- בעדינות להחליף להכניס את התרבות ולטפל כדי להסיר בועות אוויר שאולי נוצרו מתחת לפני שטח קרום.
- לאחר שההנקה הראשונה, לשנות בינוני בכל יום אחר.
5. Slices רקמות דוגרים עם אנלוגים תימידין לייבל יילוד נוירונים
- על מנת ללמודההתבגרות והאינטגרציה של תאי גרגיר המשונן בהיפוקמפוס, דגירה את פרוסות organotypic עם אנלוגי thymidine, כגון Bromodeoxyuridine (BrdU) או Chlorodeoxyuridine (CldU). כאן, אנו משתמשים CldU בגלל מסיסותו הגבוהה בתמיסת מלח.
- לאחר 3DIV, להוסיף 1 μl של 10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות CldU מלוחים עד 1 מיליליטר של מדיום התרבות לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. אם BrdU משמש, לתקן את הריכוז להבדלים במשקל מולקולרי. הוסף בינוני עם CldU לבארות תרבות ודגירת רקמה עם CldU המכיל בינוני לשעה 2 ב 35 ° C.
- בעקבות 2 שעות של דגירה על 35 ° C, להסיר את מדיום CldU המכיל ולהחליף עם מדיום האכלה קבוע כדי לחדש את לוח הזמנים האכלה רגיל (שתואר לעיל).
6. רקמות קיבוע ואחסון
- הקמת ציר זמן ליישום טיפולים ותיקון דגימות רקמה לפני תחילת ניסויי תרבות (איור 2). <li> בהודעה לנתיחה-יום שנקבע מראש, להכין את הדברים הבאים במנדף מעבדה: כוס 10-50 מיליליטר המכילה paraformaldehyde 4% (PFA) בופר פוספט (PBS); כוס ריקה למדיום התרבות הושלך; מלקחיים קטנים; ופיפטה 1000 מיליליטר עם טיפים חד פעמי.
- הסר את צלחת התרבות (שניות) מתא דגירה והעברה למנדף. הטה את הצלחת מוסיף גם הבודד עם מלקחיים. בשלב הבא, להשתמש פיפטה להסיר מדיום תרבות והעברה לכוס לרשות. הטה את צלחת התרבות בזווית כדי להבטיח שכל מדיום התרבות מוסר.
- לסיים הסרת בינונית לצלחת תרבות אחת בכל פעם. כאשר בינוני הוסר, להוסיף 1 מיליליטר של 4% PFA לכל תרבות היטב ולאטום היטב צלחת עם parafilm. חזור על פעולה עבור צלחות תרבות רבות כמו צלחות צורך והעברה למקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, להכין את הדברים הבאים במנדף: 10-50 כוס מיליליטר מכילה 0.1% יזידו הנתרן בPBS; ריקכוס לPFA מושלך (בהתאם לצעדי בטיחות כאשר השלכת חומרים רעילים); מלקחיים קטנים; ופיפטה 1000 מיליליטר עם טיפים חד פעמי.
- בצע את ההליך מתואר ב6.4 להוספת PFA, אבל להוסיף 1 מיליליטר של PBS עם אזיד הנתרן במקום. ברגע שהועבר לחלוטין, צלחות גם חותם לשימוש עתידי על ידי עטיפת קצוות בparafilm ואחסון במקרר ב 4 מעלות צלזיוס.
7. חתך רקמות לאימונוהיסטוכימיה
- לבצע רקמת חתך באמצעות vibratome. שורה של צעדים הבאים לסייע למקסם את התשואה של קטעי רקמה שמישים מתרבויות organotypic.
הערה: מייד לאחר נתיחה וציפוי של פרוסות בהיפוקמפוס, יש רקמת עובי של כ 400 מיקרומטר. עם זאת, לאחר 2-3 שבועות בתא הדגירה, פרוסות רקמה תתחיל לשטח, וכתוצאה מכך עובי חלק אחרון של 150-300 מיקרומטר. - הכן את הפריטים הבאים לרקמה תרבותית סעיף: # ב 11 אזמללְהַעֲמִיס ולהתמודד, צלחת פטרי זכוכית המכילה PBS קרח קר, מלקחיים מיקרו לנתיחה, ושלב גזירת vibratome נקי לעלות רקמות.
- השתמש באזמל כדי לחתוך בזהירות לאורך ההיקף של קרום להוסיף המעגלי כך שיכול להיות מנותק זה מדיור סוגר הפלסטיק. השאר שטח נרחב בין פרוסה התרבותית והאזמל.
- העבר את הקרום להוסיף המנותק לצלחת פטרי המכילה PBS. לאחר השטיפה בPBS, להשתמש במלקחיים כדי להעביר את הקרום לשלב ההרכבה vibratome.
- בשלב הבא, להשתמש באזמל לחסל קרום עודף סביב פרוסות תרבותיים ולחתוך משם חומר עודף כדי ליצור קצוות נקיים. צעד זה יבטיח את הקרום שטוח ובקלות יכול לדבוק במשטח החיתוך.
- מניחים 1-2 טיפות של דבק על הבמה חיתוך vibratome והתפשט באפילו שכבה באמצעות מחט 22 G. מורחים דבק לצורה מלבנית עם מקביל קצה הארוך ללהב החיתוך של vibratome. לבצע שלב זהבמהירות, כדי למנוע הדבקה מייבוש.
- שימוש במלקחיים כדי להעביר את הקרום המכיל גזוז פרוסות בהיפוקמפוס לשלב הגזירה ועדינות למקם את הקרום בדבק ולהבטיח שאין בועות אוויר.
- כדבק המגע מתייבש, להעביר את שלב vibratome עם הקרום מודבק חזרה לצלחת פטרי המכילה PBS. הכן את להב vibratome ויזיד הנתרן המכיל 48 צלחת גם לאחסן קטעי רקמה.
- השתמש בvibratome להפקה 30 מיקרומטר חלקים של הרקמה הפרוסה organotypic והעברה ליזיד הנתרן המכיל 48 צלחת גם לאחסון ומכתים immunohistochemical שלאחר מכן.
- עיין מראש קיימים פרוטוקולים ל26,29 מכתים immunohistochemical.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קביעה אם תרבויות organotypic תהיה מתאימות למחקר neurogenesis למבוגרים נדרש כי הם לספק שני קריטריונים עיקריים: 1) שפרוסות לשמור על תכונות מורפולוגיות אופייניות לפרוסות בהיפוקמפוס לאחר 10-21 ימים במבחנה (DIV), ו -2) שניתן לכמת DGCs היילוד תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical סטנדרטית המועסקות בדרך כלל במחקר neurogenesis למבוגרים. בנוגע לקריטריון הראשון, איור 1 א ו -1 B להדגיש את המורפולוגיה בהיפוקמפוס השתמרה. תכונות אופייניות כגון gyrus המשונן (DG), אזורי CA1, וCA3 הם קל לזיהוי.
בנוגע לקריטריון השני, איור 1 ג (פנל עליון) מספק מדגם מייצג של DGCs יילוד שיתוף המבטא את הסמן אנדוגני העצבי, Doublecortin (DCX) בצבע ירוק ואנלוגי thymidine אקסוגני, 5-Chloro-2'-deoxyuridine (CldU) ב אדום. נוירונים אלה נמצאים בתת-גראזור anular של DG בהיפוקמפוס. על מנת להבטיח נכונות היכרויות לידה של נוירונים, אנו מזהים CldU + גרעינים שישתפו מפורש DCX. יש צורך במיקרוסקופ Confocal בשלב זה לזהות בהצלחה הנוירונים שכותרתו כפולים, כי תאי מועמד חייבים לשתף להביע את הסמן של עניין לאורך ציר Z-התא. נתוני מדגם שהושגו עם תשואה דו-תיוג כזה כ -17% מCldU + תאים שהביעו DCX ו -35% מCldU + תאים שהביעו CaBP ב 12 ימים לאחר יישום CldU. ערך DCX הוא דומה מאוד ואילו ערך CaBP הוא נמוך משמעותי מנתון מקביל שהתקבל בvivo 26. תנאי תרבית רקמה סטנדרטיים עשויים להיות אחראים לאחוז נמוך יחסי של התאים + CaBP.
איור 2 א מציג את השלבים לנתיחה שימשיכו משמאל לימין (1-8): החל בעריפת ראשו של בעל חיים (1), הסרת המוח (2), העברה של מוח לפתרון לנתיחה קר כקרח (3), לנתחיון של ההיפוקמפוס משמאל ואונות ימין (4), אחסון של hippocampi גזור בפתרון לנתיחה קר כקרח (5), העברה של שני hippocampi למסוק רקמת Stoelting וחתך ב 400 מיקרומטר (6), הפרדת פרוסות בודדות תחת מיקרוסקופ לנתח (7), רקמת ציפוי ועל התרבות מוסיף תא (8). שתמשיך בדרך זו מסייעת לשמור על סביבת סטרילית לאורך כל תהליך התרבות.
לבסוף, מאז הזמן במהלך ההתפתחות היא תכונה חשובה של neurogenesis בהיפוקמפוס, בחרנו דגירה פרוסות התרבותית עם CldU בדיוק שעה 2 אחרי 3 DIV לתווית חלוקת תאי גזע עצביים. חלון הזמן הצר לממשל CldU נבחר כדי לשפר את הסיכוי שכותרתו נוירונים היוו אוכלוסייה הומוגנית של תאים בערך באותו שלב ההתבגרות (איור 2). לגבי תיוג CldU, תכונה קריטית אחת neurogenesis לתפקוד בהיפוקמפוס היא שבמערכת עיכולזמן ven יש אוכלוסייה הטרוגנית של תאי גרגיר המשונן בשלבי התבגרות שונים 27,28.
תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 1. דוגמא איור הדגשה השתמרו מורפולוגיה בהיפוקמפוס. (א) פרוסה Organotypic מתפקיד לנתיחה 12 ימים immunolabeled לCldU (ירוק) וCaBP (אדום), 20x תמונה מורכבת אוויר (בר סולם = 500 מיקרומטר). מיקרוסקופ (B) לדוגמא של הפרוסה מ -21 ימים שלאחר נתיחת immunolabeled לCldU ( אדום) וDCX (ירוק) (צבע-תכנית ההפך מאיור 1 א), 20x אוויר (בר = 100 מיקרומטר Scale). (פנל עליון C). נציג תמונת מיקרוסקופ confocal של תאי ClXdU וסמן עצבי בשלה אנדוגני, DCX להביע שיתוף. DGCs DCX (ירוק) וCldU (אדום) להביע שיתוף נספרים כנוירונים יילוד. חץ מצביע כפול labeהוביל תא בשלב המוקדם של פיתוח, נפט הטבילה 40X (Scale בר = 10 מיקרומטר). תאים דומים נצפו 10 ימים לאחר תיוג-in vivo 26. פנל תחתון. תמונות ניאון נציג של תאי CldU (ירוק) וCaBP (אדום) להביע שיתוף. החץ מצביע על תא שכותרתו כפול, 40X מיקרוסקופ פלואורסצנטי (בר = 10 מיקרומטר Scale). gyrus DG-המשונן. GCL-גרגר שכבת תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. איור איור (א) לצעדים רציפים לנתיחה בהיפוקמפוס בספסל נקי זרימה למינרית. קו מקווקו מציין (מימין) אזורים "לא סטרילי" (משמאל) ו" סטרילי "של האזור לנתיחה. ציר זמן (B) לאורגןתרבויות הפרוסה typic הוכנו מגורי החולדה P7 (להתחיל). סימונים מצביעים יישום של אנלוגי thymidine, CldU *, ו" טיפול ", שיכול לכלול סוכנים תרופתיים שונים, מתאימים לשאלה הניסיונית. תרבויות קבועות עם paraformaldehyde בזמנים להתעכב רצויים מיישום CldU (תקן תרבויות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שם מגיב / ציוד | חברה | מספר קטלוגי | תגובות / תיאור |
| 5-כלורו-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105,478 | מסוכן, מסרטנים |
| תרבית תאים מוסיפה, קוטר 30 מ"מ, p 0.4 מיקרומטרגודל עפרות | Thermo המדעי | 140,660 | ציפוי דלתא Nuclon על מוסיף אלה מספק הידבקות רקמות טובה יותר ומשפר את האיכות פרוסה. |
| חרוטי צנטריפוגה צינורות (סטרילי) | פישר סיינטיפיק | 14-432-22 | |
| מספריים מבתר (זווית לצד) | כלי מדע פיין | 14,082-09 | |
| בינוני מינימום הכרחי (MEM) | Gibco | 11,095; נוזל | חנות ב 4 ° C |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי Eclipse Ni-U | Nikon | ||
| דבק לרקמה | בדבק מגע דבק | KG585 | השתמש בכמות מינימאלית של דבק כדי להשיג הידבקות כמו כל רקמה שנחשפה לדבק תהיה שמיש עבור IHC. |
| מאוזן תמיסת מלח של האנק (HBSS) (500 מיליליטר) | Gibco | 14025-092 | חנות ב 4 ° C |
| סוס סרום חום מומת (500 מיליליטר) | Gibco | 16050-122 | לעשות 50 מיליליטר aliquots ולאחסן ב -20 ° C |
| Kimwipes | קימברלי קלארק- | TW 31KYPBX | |
| טפטפות זכוכית שונה (חלק תחתון של פיפטה פסטר הוסר וקצה החליק עם להבה בונזן) | |||
| צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) ו- (60 מ"מ x 15 מ"מ) | פישר מותג | FB0875712 וFB0875713A | |
| להבי אזמל # 11 | כלי מדע פיין | 10,011-00 | |
| ידית # אזמל 3 | כלי מדע פיין | 10,003-12 | |
| Pipettes סרולוגיות | Sorfa רפואי פלסטיק ושות ' | P8050 | |
| מלקחיים תבנית סטנדרטיים | כלי מדע פיין | 11,000-12 | |
| מסנן ואקום סטרילי | Thermo-מדעי | 565-0020 | |
| מספריים כירורגיות | כלי מדע פיין | 14,054-13 | |
| יחידת מסנן מזרק מונע | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| מסוק רקמות עם שלב ניד | Stoelting | 51,425 | |
| מכחול קצה קנס |
ספקי 1. שולחן וריאגנטים
| פתרון | מצרכים והוראות |
| פתרון לנתיחה | ) 500 מיליליטר של האנק ו# 39; s מאוזן תמיסת מלח (HBSS) (Gibco-14,025-092). |
| ב) הוספת D-גלוקוז 2.2 g. | |
| ג) הוסף 0.5 סוכרוז g. | |
| ד) הוסף 1.787 HEPES g. | |
| ה) מערבבים במשך 30 דקות עם צלחת ומערבבים מגנטית. | |
| ו) השימוש pH מטר כדי להבטיח פתרון יש pH = 7.4 סופי. | |
| ז) השתמש osmometer כדי להבטיח osmolality הסופי = 320-330 mOsm. | |
| h) לעקר פתרון בזרימה למינרית סטרילי באמצעות סינון ואקום באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. | |
| סרום המכיל מדיום תרבות: 100 מיליליטר מינימאלי חיוני בינוני (MEM) (Gibco 11,095), 50 מיליליטר סרום סוסים (Gibco 16,050-122), 50 מיליליטר HBSS. | א) להוסיף את הדברים הבאים 50 מיליליטר HBSS בכוס ולפזר 37 ° C אמבט מים. מערבבים עם בוחש מגנטי. |
| ב) D-גלוקוז 1.3 g. | |
| ג) 36 מ"ג 4 MgSO. | |
| ד) חומצת אסקורבית 17.6 מ"ג. | |
| ה) 5 μl של פתרון 2 מניות 2M CaCl. | |
| ו) הוסף 50 μl אנטיביוטיקת antimycotic (100x מניות, סטרילי; Gibco 15,140-062). | |
| ז) 1 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין. | |
| h) לעקר לעיל פתרון על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. | |
| i) פתרון Mix מסונן עם 100 מיליליטר ממ ו -50 מיליליטר סרום סוסים בזרימה למינרית. | |
| j) הפוך aliquots 50 מיליליטר בצינורות צנטריפוגות חרוטי סטרילי (פישר סיינטיפיק-14-432-22) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. | |
| 4% פתרון מקבע Paraformaldehyde. | א) בופר פוספט (PBS) הכן על ידי הוספה הבאה ל -300 מיליליטר של מזוקק H 2 O וערבוב על צלחת ומערבבים מגנטית. |
| ב) הוספה 2.7 monobasic פוספט נתרן g (אא 2 PO 4). | |
| ג) להוסיף phosphat נתרן 11.5 gdibasic דואר (4 NaHPO). | |
| ד) הוסף 9.0 כלוריד g נתרן (NaCl). | |
| ה) מחממים כ. 700 מיליליטר של מזוקק H 2 O ל -55 מעלות צלזיוס ולכבות את החום. | |
| ו) להוסיף paraformaldehyde 40 גרם (PFA) ומערבבים לתוך 700 מיליליטר של מים באמצעות צלחת ומערבבים מגנטית. | |
| ז) מערבבים את PBS (a, b, c, d) ופתרונות PFA (ה, ו), להתאים את ה- pH ל 7.4 ועליון עד נפח סופי של 1,000 מיליליטר. | |
| 0.1% נתרן יזיד פתרון | ) הוסף 1G של אזיד הנתרן אבקה (NaN 3) ל1 ליטר של פתרון PBS. |
| ב) Mix באמצעות צלחת ומערבבים מגנטית ולאחסן ב 4 ° C. |
פתרונות 2. טבלה ומתכונים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעקבות ממשל CldU (או BrdU), ניתן לבחור את ציר הזמן של יישום של סוכנים תרופתיים למקד DGCs יילוד בחלונות התפתחות מסוימים. לדוגמא, סוכן היפותטי ניתן ליישם במהלך הזרקת שבוע שלאחר CldU השני, שמוצע בקנה אחד עם הגיל של נוירונים בוגרים שנמצאים בשלב ההתפתחותי שבו GABA הוא depolarizing. מחקרים עתידיים תוך שימוש בפרוטוקול זה יכול להתאים את הסוכן התרופתי וחלון חשיפה ל" חייט "הגישה לשאלת הניסוי הספציפית של עניין.
קריטריון חשוב לקביעה כי בתרבויות הפרוסה הן מודל תקף למחקר neurogenesis לאחר לידה הוא היכולת להכתים ולכמת נוירונים יילוד בהיפוקמפוס. שני הממצאים העיקריים בתמיכה של השערה זו היו שניתוח מיקרוסקופי חשף תגובתיות immunohistochemical לCldU וסמני חלבון אנדוגני באותה נוירונים.כאשר משתמשים בשילוב עם סמנים עצביים אנדוגני, אנלוגים thymidine כגון BrdU וCldU הם כלים רבי עוצמה עבור מחקר neurogenesis.
היישום של אנלוגים thymidine, כגון BrdU, באמצעות זריקות intraperitoneal מנוצל בדרך כלל במחקר neurogenesis לנוירונים תווית עוברים S-שלב של מיטוזה 29. יכולות להיות מועסקות גישות דומות בתרבויות organotypic עם שינויים מסוימים. לדוגמא, מחקרים קודמים מנוהלים BrdU (0.5 מיקרומטר במשך 3 ימים) לחתוך תרבויות אחרי ~ 14 DIV 18. בדיקת הנתונים שהוצגו במאמר שמגלה כי חלק מהמדדים המשמש לכימות neurogenesis לא להעסיק את הטכניקות סטנדרטי המשמשות בתחום נוירוגנזה, כלומר, כימות stereological 30. לדוגמא, כאשר דיווחו על שיתוף הביטוי של BrdU ועצבי-גרעינים (NeuN) תאים חיוביים, הם מצביעים על מספר כולל של תאים "לתרבות" במקום לספק להודיעation לגבי אזור רקמה או נפח.
מחקרים מאוחרים יותר השתפרו בשיטה זו על ידי חתך פרוסות בתרבית לבודד 10 מיקרומטר סעיפים, ששפרו את הפרוטוקולים להדמיה ואימונוהיסטוכימיה כך שהוא מאפשר נוגדנים לחלחל יותר בקלות דגימות רקמת 31. דרגש et al. 28 דיווחו תיוג כפול עם BrdU (10 מיקרומטר במשך 3 ימים) כמספר התאים שכותרתו שיתוף לכל 10 מיקרומטר סעיף, אך לא ספקו מידע על האזור ההשוואתי או האזור בהיפוקמפוס הספציפי למד כלומר, CA1, CA3 או DG. בנוסף, ניתוח של תמונות מיקרוסקופיה confocal וקרינה אינו משכנע מראה כי המורפולוגיה בהיפוקמפוס נשמרה בהצלחה.
חשוב לציין, שני המחקרים השתמשו בתקופת חשיפת BrdU של 3 ימים, אשר משויכת חסרונות. תיוג BrdU סייע מחקרי neurogenesis מאוד כך שהוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תאים מתחלקים חדש בvaאזורים במוח rious. עם זאת, רעילות BrdU יש גם מאופיינת היטב. השימוש בו הוכח לגרום לחריגות מורפולוגיות והתנהגות 32,33 והשפעות שליליות על מחזור התא, בידול, הגירה והישרדות של תאי גזע עצביים 34-36. הממשל הממושך של BrdU במחקרים שהוזכרו קודם לכן ייתכן שהציג משתנים מבלבלים ששינו את הפיסיולוגיה בהיפוקמפוס ובעוד כמה תופעות לוואי מממשל BrdU עלולות להיות בלתי נמנעות, פרוטוקול הניסוי שלנו נועד להגביל חלק מסיבוכים אלה על ידי דוגרים הרקמה עם אנלוגים thymidine ל שעה 2. בנוסף, בחרנו להשתמש CldU במקום BrdU כי זה הראה מסיסות טובה יותר מאשר BrdU בעת הכנת פתרון דוגרים. אף על פי פרוטוקול 3 היום עשוי להיות שימושי עבור דוגמא עיצובים ניסיוניים מסוימת, למקסם את התיוג של תאים מתרבים, יש פרוטוקול שעה 2 זה יתרון של דופק תיוג של popula קטן יחסיתtion של תאים שניתן ללמוד בזמנים הישרדות רצויים (ראה איור 2).
על ידי השוואת רמת הייצור העצבי הבא שתי שיטות שונות של יישום BrdU, Namba et al. תרמו תרומה חשובה לטכניקות תיוג בתרבויות הפרוסה organotypic 37. הזרקת המחברים intraperitoneal השוואה (IP) של BrdU (50 מ"ג / קילוגרם) בחולדות לאחר לידה 5 יום (P5) עם במבחנה תרבויות שקיבלו בינוני תרבות המכיל 1 מיקרומטר BrdU למשך 30 דקות הבאות explantation של רקמה באופן מיידי. הם מדווחים על הבדל משמעותי מבחינה סטטיסטית בין לא ב- vivo ובמבחנת הזרקת BrdU מוקדם ברקמה תרבותית. המחברים לא הציגו תמונות ברורות המפרטות את המבנה בהיפוקמפוס, אבל הם מדווחים immunoreactivity BrdU באחוזים של תאים הכולל בשכבת תאי גרגיר. בזמן שהם מעסיקים ספירת stereological, מתן מידה על ידי שטח או נפח יהיה בעל ערך. באופן כללי, תרבויות organotypic הנוכחיות מחקרים מצוטטים כיסודיים המפרט של תרבויות הפרוסה בהיפוקמפוס לאחר לידה, עם בקשות למחקר הנוירוגנזה והפרעות תרופתיות. שימוש בטכניקה זו, יכולה להישמר פרוסות בהיפוקמפוס עד 21 ימים במבחנה (DIV) וניתן להוסיף תרופות למדיום בכל נקודה בתקופת התרבות כדי לחקור את ההשפעה על neurogenesis.
המטרה שלנו הייתה לתייג אוכלוסייה בדידה, הומוגני יחסית של DGCs על ידי מתן יישום קצר "דופק" של CldU עבור שעה 2. אסטרטגיה נפוצה מועסק אחד ללימוד neurogenesis של זיהוי של שלב ההתבגרות של נוירון באמצעות מכתים immunohistochemical עבור סמני אנדוגני שונים עם אנלוגי thymidine. מיקרוסקופיה Confocal והקרינה אישרה את נוכחותו של גרעינים שהתאגדו CldU האנלוגי thymidine ולפיכך באופן פעיל בתהליך מיטוזה בתקופת התרבות. איור 2 ב- vivo יכולים להיות מותאמים לתרבויות פרוסה.
באופן ספציפי, שיטה נפוצות במחקר neurogenesis היא לבצע מכתים immunohistochemical לחלבון microtubule קשורה, DCX, אשר באו לידי ביטוי בעיקר בתאי עצב לא בוגר מיום 3-21 והסמן העצבי הבוגר, Calbindin (CaBP), אשר באו לידי ביטוי באופן מלא הבאים 28 ימים לאחר מיטוזה. הפנוטיפ של תאי CldU + נקבע באמצעות סמני אנדוגני אלה 26.
שיטות משופרות לשמירה על תרבויות פרוסה לתקופות ארוכות יותר עשויות להיות יתרון נוסף של ומאפשר יותר CldU + נוירונים להגיע הבוגר, CaBP + שלב. בשלב נוכחי, מגבלה אחת של גישת תרבות organotypic היא שהרקמה משתנות ללא הרף במהלך תקופת התרבות. כך למשל, בעקבות נתיחה וציפוי בהיפוקמפוס של פרוסות באופן מיידי, tiיש ssue רוחב של כ 400 מיקרומטר. עם זאת, לאחר 2-3 שבועות בתא הדגירה, פרוסות רקמה תתחיל דק, מה שגורם ברוחב סופי בין 250-350 מיקרומטר. זה מגביל את כמות הרקמה שיכול לשמש לאימונוהיסטוכימיה ויש לשקול בעת תכנון כמה בעלי חיים לשימוש עבור פרויקט. ניסויים נוספים יעזרו לאפיין את השינויים התפקודיים בפיזיולוגיה בהיפוקמפוס המתרחשים במבחנה.
הפרוטוקול עבור חתך ומכתים פרוסות בהיפוקמפוס פותח כדי לנתח שינויים תאיים ומורפולוגיים המתרחשים בתקופת culturing. תרבויות פרוסה מספקות הזדמנות לבחון את ההשפעה של סוכנים תרופתיים שונים כDGCs היפוקמפוס עובר שלבי התפתחותיים שונים במהלך התבגרות ומייצג כלי רב ערך ללימודי neurogenesis למבוגרי עתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A.
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H.
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
