Summary
نحن هنا وصف تقنية لدراسة تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة قرن آمون باستخدام تقنية عضوي النمط ثقافة شريحة. هذا الأسلوب يسمح للفي المختبر التلاعب في تكوين الخلايا العصبية الكبار ويسمح التطبيق المباشر من وكلاء الدوائية إلى الحصين مثقف.
Abstract
نحن هنا وصف تقنية لدراسة تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة قرن آمون في الدماغ القوارض باستخدام تقنية عضوي النمط ثقافة شريحة. يحافظ هذا الأسلوب التشكل الطبوغرافية المميزة للقرن آمون في حين يسمح التطبيق المباشر من وكلاء الدوائية إلى تطوير التلفيف المسنن قرن آمون. بالإضافة إلى ذلك، الثقافات شريحة يمكن الحفاظ لمدة تصل إلى 4 أسابيع، وبالتالي، يسمح احد لدراسة عملية نضوج الخلايا العصبية الحبيبية حديثي الولادة. الثقافات شريحة تسمح للتلاعب الدوائي الفعال للشرائح قرن آمون مع استبعاد المتغيرات المعقدة مثل عدم اليقين المتعلقة الموقع التشريحي العميق للحصين وكذلك حاجز الدم في الدماغ. لهذه الأسباب، سعينا لتحسين الثقافات شريحة عضوي النمط خصيصا لبحوث الخلايا العصبية بعد الولادة.
Protocol
ملاحظة: تتفق جميع الإجراءات الحيوانية على صحة ورفاهية الحيوان المبادئ التوجيهية من قسم الطب المقارن في جامعة تورونتو.
1. إعداد شرائح الحصين
- تعقيم الأدوات التالية باستخدام الأوتوكلاف جافة في 125 ° C: مقبض مشرط (# 3) (2)، ملقط نمط قياسي، كبير (1)، مشرح مقص صغير (الزاوية إلى جنب) (1)، مايكرو ملعقة (ملعقة وشقة نهايات ملعقة) (1)، مايكرو-ملاعق (مدورة واعتقلت طرفي مدبب) (2)، ودفع غرامة الرسام (1)، مصقول النار ماصة باستير (2)، والساحات شاش، 2 × 2 بوصة (5).
- عندما عقيمة، وطرح الصكوك في وعاء معقم والحفاظ مغطاة حتى الاستخدام. مباشرة قبل التشريح، وتزج الأدوات في حل الايثانول 70٪.
- إعداد لوحة الثقافة 6-جيدا مع إدراج الثقافة قبل البدء في إجراء تشريح عن طريق إضافة 1 مل من مستنبت / جيدا وتخزينها لوحة في الحاضنة عند 35 ° C لالثانية 5٪ CO 2.
2. ترتيب أدوات تشريح في غطاء محرك السيارة العقيمة تدفق رقائقي
- رش غطاء تدفق الصفحي مع 70٪ من الإيثانول وإزالة أدوات تشريح تعقيمها من الكحول. السماح الصكوك لتجف في حين يستريح على طبق بتري معقمة لتجنب الاتصال بين الكحول وأنسجة المخ تشريح.
- إيداع 5-7 مل من محلول معقم تشريح الجليد الباردة في أطباق بتري معقمة 2 الكبيرة. واحدة طبق البرد وتنظيف الرأس (القذرة)، والآخر للتبريد والشطف وحصد من الدماغ (نظيفة). وضع ورقة فلتر تعقيمها في واحدة من الأغطية طبق بتري لتشريح خارج الدماغ.
- وضع، ورق الترشيح صغيرة تعقيمها في واحدة من بتري غطاء صحن صغير لتشريح خارج الحصين. إيداع 3-5 مل من محلول معقم تشريح الجليد الباردة في 2 صغيرة، أطباق بتري معقمة. واحدة طبق عقد الحصين مغروف، واحدة سوف تعقد خلال أقسام فصل أقسام الحصينتحت المجهر تشريح.
- إعداد المروحية الأنسجة عن طريق تسجيل قطعة من ورق الترشيح تعقيم إلى مرحلة القطع وتصاعد شفرة حلاقة معقمة. الرطب ورقة الترشيح مع حل تشريح تعقيمها.
- رش نظيفة كيس الحيوي مع الكحول ووضعه في تدفق الصفحي مقاعد البدلاء النظيفة.
3. الحصين تشريح
- رش الفئران الجرو P7 سبراغ داولي مع الايثانول 70٪ خارج تدفق الصفحي مقاعد البدلاء نظيفة وبسرعة قطع رأس الحيوان باستخدام مقص جراحي معقم كبيرة داخل مقاعد البدلاء تدفق الصفحي. السماح إسقاط رئيس في حل تشريح الجليد الباردة في واحدة من أطباق بتري.
- في طبق بيتري، وشطف قبالة الدم وسرعة نقل الرأس إلى ورق الترشيح تعقيم، الجانب البطني أسفل.
- باستخدام مشرط، وقطع على طول السطح الظهري في المستوى السهمي لفضح الجمجمة الأساسية. قطع طريق الجلد، ولكن ليس العظام الكامنة، التي هي لينة واختراقها بسهولة في الفئران رعمره. نقض هذا "القذرة" مشرط وعدم استخدام على أنسجة المخ.
- باستخدام مقص صغير مشرح (الزاوية إلى جنب) وملقط، وقطع مفتوحة الجمجمة على طول الدرز السهمي من الجمجمة إلى bregma، وهذه النقطة التشريحية على الجمجمة حيث تتقاطع خياطة الاكليلية عموديا من الدرز السهمي. استخدام ملقط لسحب اللوحات الجمجمة وحتى بعيدا عن خط الوسط من الجمجمة.
- ضع ملعقة صغيرة على الجانب السفلي من الدماغ، تحت جذع الدماغ، لرفع بلطف الدماغ من الجمجمة. رفع المخ لفضح الأعصاب البصرية والبصلة الشمية على سطح القاعدية من المخ. قطع هذه الهياكل مع مقص صغير لفصل كامل الدماغ من الجمجمة. إزالة ونقل الدماغ سليمة إلى الآخرين طبق بيتري كبيرة تحتوي على حل تشريح الجليد الباردة.
- باستخدام ملعقة صغيرة، ونقل الدماغ إلى غطاء صغير بيتري صحن يحتوي ورق الترشيح العقيمة. مع ماصة باستور العقيمة، وشطف الدماغ مع بضع قطرات من ديسsecting حل للحفاظ على الأنسجة رطبة.
- باستخدام "نظيفة" شفرة مشرط قطع نصفي الكرة الأرضية على حدة. نقل نصف الكرة المخية الأيسر إلى طبق بيتري كبيرة مع ملعقة صغيرة ووضع نصف الكرة الجانب الحنون عليها في حل تشريح الجليد الباردة لاستخدامها لاحقا.
- عرض الوجه الإنسي النصف الأيمن وتحديد القبو الحافة، عصابة بارزة من المادة البيضاء على طول الحافة وسطي من الحصين. باستخدام مشرط معقم، وجعل خفض السهمي من خلال القبو، ولكن الحرص لسم فقط 0.5 من طرف مشرط ستكون كافية لخفض القبو.
- باستخدام 2 ملاعق صغيرة، وإزالة الحصين الأول من النصف الأيمن عن طريق وضع اليد اليمنى-ملعقة على جذع الدماغ ورفع القشرة الفوقية مع ملعقة الأيسر. رفع بلطف القشرة للكشف عن البطين الجانبي والسطح الإنسي من الحصين. والخط المنحني الأبيض، والخمل، وينبغي أن يكون الآن مرئية.
- محاذاة انحناء ملعقة مع curvaالبنية من الخمل وبلطف اضغط على ملعقة تحت الخمل. حرك ملعقة اليسار وركوب على طول محور منقاري الذيلية ثم ارفع الملعقة في اتجاه والظهرية لإزالة الحصين.
- نقل الحصين إلى 2 طبق بيتري صغير الثانية مع الحل تشريح الجليد الباردة. كرر نفس الإجراء على نصف الكرة المخية الأيسر لإزالة الحصين الأيسر.
- باستخدام ملعقة صغيرة، ونقل بعناية الحصين إلى مرحلة المروحية الأنسجة. ترتيبها المجاورة وموازية لبعضها البعض وعمودي على محور النصل المروحية. استخدام الفرشاة لوضع الأنسجة وإضافة بضع قطرات من الحل تشريح على رأس الحصين.
- قطع الأنسجة في 400 ميكرون شرائح دون التوقف لإزالة شرائح الفردية (عادة أنها لن تنضم إلى شفرة). بعد أن تم قطع الحصين كله، استخدم الفرشاة بلطف لنقل المقاطع ل2 طبق بيتري صغير الثانية مع الحل تشريح.
- تحت الإعلانيةissecting المجهر، فصل بعناية شرائح العائمة باستخدام amicro-ملعقة والفرشاة.
- إزالة لوحة الثقافة معدة سلفا مع إدراج الثقافة من الحاضنة ومكان في غطاء تدفق الصفحي.
- باستخدام ماصة باستير مصقول النار، ورسم 4-5 شرائح في ماصة ونقل شرائح إلى السطح قمية من الغشاء إدراج الثقافة. التالي، وضبط وتحديد المواقع مع الفرشاة وترك مسافة بين المقاطع الفردية والحدود من إدراج الثقافة.
- باستخدام ماصة باستور العقيمة، وإزالة الحل تشريح الزائد من سطح قمية من الغشاء.
ملاحظة: في حين إزالة الحل تجنب رسم أقسام الأنسجة في ماصة. بدلا من ذلك، استخدم ماصة العادية (P200 أو P1000) مع نصائح ماصة معقمة لإزالة ببطء الحل. - وضع لوحة الثقافة مع المحتوية على مصل الثقافة المتوسطة وشرائح قرن آمون العودة الى الحاضنة في 35 ° C وCO 2 5٪.
ملاحظة: إذا المكالمات التجربةلتوليد الثقافات من الحيوانات متعددة، تنظيف شامل على مقاعد البدلاء نظيفة تدفق الصفحي بين تشريح. العودة إلى أدوات حل الكحول واستبدال جميع بيتري الأطباق، وأوراق الترشيح وشفرات الحلاقة المعقمة قبل تشريح الثاني.
4. التغذية والحفاظ على عضوي شرائح
- ثقافات الأعلاف في تدفق الصفحي معقمة مقاعد البدلاء النظيفة.
- أداء تغذية الأولى من أقسام مثقف 2 يوما بعد تشريح. نضح مستنبت القديمة باستخدام معقم ماصة الزجاج.
- استخدام معقمة 5 مل ماصة المصلية لإضافة 1 مل من جديد، عقيم، التي تحتوي على مصل المتوسطة إلى الآبار.
- استبدال بلطف إدراج الثقافة ورعاية لإزالة أي فقاعات الهواء التي قد تكون تشكلت تحت سطح الغشاء.
- بعد الرضاعة الأولى، تغيير المتوسطة كل يوم.
5. احتضان شرائح الأنسجة مع ثيميدين النظائر لتسمية الوليد الخلايا العصبية
- من أجل دراسةنضج وتكامل الخلايا الحبيبية المسنن في قرن آمون، احتضان شرائح عضوي النمط مع التناظرية ثيميدين، مثل Bromodeoxyuridine (BrdU) أو Chlorodeoxyuridine (CldU). هنا، ونحن نستخدم CldU بسبب الذوبان العالي، في المياه المالحة.
- بعد 3DIV، إضافة 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل CldU حل الأسهم في المياه المالحة إلى 1 مل من مستنبت لتركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. إذا تم استخدام BrdU، تصحيح تركيز الاختلافات في الوزن الجزيئي. إضافة المتوسطة مع CldU إلى الآبار الثقافة واحتضان الأنسجة مع CldU التي تحتوي المتوسطة لمدة 2 ساعة على 35 درجة مئوية.
- بعد 2 ساعة من الحضانة عند 35 درجة مئوية، وإزالة المتوسطة CldU التي تحتوي على واستبدالها مع المتوسطة تغذية منتظمة لاستئناف الجدول الزمني للتغذية العادية (المذكورة أعلاه).
6. الأنسجة التثبيت والتخزين
- تحديد جدول زمني لتطبيق العلاجات وتحديد عينات الأنسجة قبل بدء التجارب الثقافة (الشكل 2B). <لى> وفي ما بعد تشريح أيام محددة سلفا، وإعداد التالية في غطاء الدخان المختبر: دورق 10-50 مل تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)؛ على كوب فارغ لتجاهل مستنبت، ملقط الصغيرة؛ وماصة 1،000 مل مع نصائح التخلص منها.
- إزالة لوحة الثقافة (ق) من غرفة الحضانة ونقل إلى غطاء الدخان. إمالة الفردية إدراج لوحة جيدا مع ملقط. المقبل، واستخدام ماصة لإزالة مستنبت ونقل إلى دورق التخلص منها. إمالة لوحة الثقافة في زاوية للمساعدة على ضمان أن تتم إزالة جميع مستنبت.
- إنهاء إزالة المتوسطة لوحة الثقافة في وقت واحد. عندما تمت إزالة المتوسطة، إضافة 1 مل من 4٪ PFA إلى كل ثقافة جيدا وختم لوحة جيدا مع parafilm. تكرار لكثير من لوحات لوحات الثقافة اللازمة ونقل إلى الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- بعد 24 ساعة، وإعداد التالية في غطاء الدخان: 10-50 مل دورق يحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني. فارغةدورق لتجاهل PFA (اتبع احتياطات السلامة عند التخلص من المواد السامة)؛ ملقط الصغيرة؛ و 1،000 مل ماصة مع نصائح التخلص منها.
- اتبع الإجراء المذكورة في 6.4 لإضافة PFA، ولكن إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم بدلا من ذلك. مرة واحدة نقله تماما، لوحات ختم تماما للاستخدام في المستقبل من خلال التفاف حواف في بارافيلم وتخزينها في الثلاجة على 4 درجات مئوية.
7. باجتزاء الأنسجة لالمناعية
- أداء الأنسجة باجتزاء باستخدام vibratome. السلسلة التالية من الخطوات تساعد على تعظيم العائد من أقسام الأنسجة التي يمكن استخدامها من الثقافات عضوي النمط.
ملاحظة: مباشرة بعد تشريح الحصين والطلاء من شرائح، والأنسجة لديها سمك حوالي 400 ميكرون. ومع ذلك، وبعد 2-3 أسابيع في غرفة الحضانة، وسوف تبدأ شرائح الأنسجة لشد، مما أدى إلى سمك الباب الأخير من 150-300 ميكرون. - اعداد العناصر التالية لقسم الأنسجة مثقف: أ # 11 مشرط بLADE والتعامل معها، وكوب طبق بتري تحتوي على الجليد PBS الباردة، وملقط تشريح الصغرى، ونظيفة مرحلة قطع vibratome لتركيب الأنسجة.
- استخدام مشرط لقطع بعناية على طول محيط الغشاء إدراج دائري بحيث يمكن فصل من السكن إدراج البلاستيك. ترك مساحة واسعة بين شريحة مثقف ومشرط.
- نقل الغشاء إدراج فصل إلى طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني. بعد الشطف في برنامج تلفزيوني، واستخدام ملقط لنقل الغشاء إلى مرحلة vibratome المتزايدة.
- وبعد ذلك، استخدام مشرط لإزالة غشاء الزائد المحيطة شرائح مثقف وقطع المواد الزائدة لخلق حواف نظيفة. هذه الخطوة ستضمن الغشاء مسطحة ويمكن أن تنضم بسهولة إلى سطح القطع.
- وضع 1-2 قطرات من مادة لاصقة على المسرح قطع vibratome وانتشارها في طبقة حتى باستخدام إبرة 22 G. نشر لاصقة في شكل مستطيل مع الحافة بالتوازي طويلا لنصل قطع من vibratome. تنفيذ هذه الخطوةبسرعة، لمنع لاصق من التجفيف.
- استخدام ملقط لنقل الغشاء قلص تحتوي على شرائح الحصين إلى مرحلة القطع وبلطف وضع غشاء على الغراء والتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء.
- كما يجف superglue، ونقل المرحلة vibratome مع غشاء لاصق العودة الى PBS تحتوي على طبق بتري. إعداد شفرة vibratome و48 لوحة جيدا أزيد تحتوي على الصوديوم لتخزين أقسام الأنسجة.
- استخدام vibratome لتوليد 30 ميكرومتر أقسام الأنسجة شريحة عضوي النمط ونقل إلى 48 لوحة جيدا تحتوي على أزيد الصوديوم للتخزين وتلطيخ المناعى لاحق.
- الرجوع إلى ما قبل القائمة بروتوكولات لالمناعى تلطيخ 26،29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديد ما إذا كان الثقافات عضوي النمط سيكون مناسبة لبحث تكوين الخلايا العصبية الكبار المطلوبة من استيفاء معيارين رئيسيين: 1) أن شرائح الحفاظ على السمات المورفولوجية المميزة لشرائح قرن آمون بعد 10-21 يوما في المختبر (DIV)، و 2) أن DGCS حديثي الولادة يمكن كميا باستخدام تقنيات المناعى القياسية استخداما في البحوث تكوين الخلايا العصبية الكبار. وفيما يتعلق المعيار الأول، الشكل 1A 1B وتسليط الضوء على مورفولوجيا الحصين الحفاظ عليها. السمات المميزة مثل التلفيف المسنن (DG) والمناطق CA1، CA3 ويمكن تمييزها بسهولة.
وفيما يتعلق المعيار الثاني، الشكل 1C (اللوحة العليا) على عينة تمثيلية من DGCS حديثي الولادة المشارك يعبرون عن علامة الذاتية العصبية، Doublecortin (DCX) باللون الأخضر وثيميدين التناظرية خارجي، 5-كلورو-2'-deoxyuridine (CldU) في الأحمر. وتقع هذه الخلايا العصبية في غرام الفرعيمنطقة anular من DG قرن آمون. من أجل ضمان الصحيح الولادة التي يرجع تاريخها من الخلايا العصبية، نحدد CldU + نوى أن تشارك في التعبير عن DCX. وهناك حاجة المجهري متحد البؤر في هذه المرحلة تحديد بنجاح الخلايا العصبية المزدوج المسمى لأن الخلايا المرشح يجب أن تشارك في التعبير عن علامة من الفائدة في جميع أنحاء Z-محور الخلية. البيانات التي تم الحصول عليها عينة مع مثل هذا العائد المزدوج وضع العلامات ما يقرب من 17٪ من CldU + الخلايا التي أعرب DCX و 35٪ من CldU + الخلايا التي أعرب CaBP في 12 يوما بعد تطبيق CldU. قيمة DCX هي مشابهة جدا في حين أن قيمة CaBP هي أقل بكثير من الرقم المقابل حصلت في الجسم الحي 26. شروط زراعة الأنسجة القياسية قد تكون مسؤولة عن نسبة منخفضة نسبيا من CaBP + الخلايا.
ويعرض الشكل 2A الخطوات تشريح أن ننطلق من اليسار إلى اليمين (1-8): بدءا من قطع رأس الحيوان (1)، وإزالة المخ (2)، ونقل الدماغ على حل تشريح الجليد الباردة (3)، تشريحأيون من الحصين من اليسار واليمين نصفي الكرة الأرضية (4)، وتخزين الحصين تشريح في حل تشريح الجليد الباردة (5)، ونقل كل من الحصين إلى Stoelting الأنسجة المروحية وباجتزاء في 400 ميكرون (6)، والفصل بين شرائح الفردية تحت المجهر تشريح (7)، والطلاء النسيج على إدراج ثقافة خلية (8). وانطلاقا بهذه الطريقة يساعد في الحفاظ على بيئة معقمة خلال عملية الثقافة.
وأخيرا، منذ بالطبع الوقت للتنمية هو سمة هامة من سمات تكوين الخلايا العصبية قرن آمون، اخترنا لاحتضان شرائح مثقف مع CldU بالضبط 2 ساعة بعد 3 DIV لتسمية تقسيم الخلايا الجذعية العصبية. وقد تم اختيار النافذة الوقت ضيق للإدارة CldU لتحسين احتمال أن المسمى شكلت الخلايا العصبية يبلغ عدد سكانها متجانس من الخلايا تقريبا في نفس المرحلة يجرونها (الشكل 2). وفيما يتعلق التوسيم CldU، ميزة واحدة الحرجة من تكوين الخلايا العصبية لوظيفة قرن آمون هو أنه في غيالوقت فين هناك السكان غير متجانسة من الخلايا الحبيبية المسنن على مختلف مراحل يجرونها 27،28.
الشكل 1. عينة الصور مضان المجهر يسلطون الضوء على الحفاظ على التشكل قرن آمون. (A) شريحة عضوي النمط من 12 أيام آخر تشريح immunolabeled لCldU (الأخضر) وCaBP (الحمراء)، 20x وصورة مركب الهواء (شريط مقياس = 500 ميكرون). (ب) صورة مجهرية عينة من شريحة من 21 يوما ما بعد تشريح immunolabeled لCldU ( أحمر) وDCX (الأخضر) (المعاكس اللون مخطط الشكل 1A)، 20x والهواء (مقياس بار = 100 ميكرون). (C) لوحة الوجه القبلي. تمثيلية متحد البؤر المجهر صورة لخلايا شارك في التعبير عن ClXdU والذاتية علامة العصبية غير ناضجة، DCX. DGCS تحسب DCX (الخضراء) وCldU (الحمراء)، معربا عن المشارك باسم الخلايا العصبية الأطفال حديثي الولادة. السهم يشير إلى المزدوج ابيقاد الخلية في مرحلة مبكرة من التنمية، 40X النفط الغمر (مقياس بار = 10 ميكرون). وقد لوحظت خلايا قابلة للمقارنة 10 أيام بعد وضع العلامات في الجسم الحي 26. اللوحة السفلى. الصور الفلورسنت التمثيلية للخلايا CldU (الأخضر) وCaBP (الحمراء) تعبير عن ثاني أكسيد الكربون. السهم يشير إلى وجود خلية المزدوج المسمى، 40X مجهرية الفلورسنت (مقياس بار = 10 ميكرون). التلفيف المسنن DG-. GCL-الحبيبية طبقة الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. (A) رسم توضيحي لخطوات متتابعة للتشريح الحصين في تدفق الصفحي مقاعد البدلاء النظيفة. خط منقط يشير "غير معقمة" (يسار) و "العقيمة" (يمين) مناطق المنطقة تشريح. (ب) الجدول الزمني للالعضويالثقافات شريحة typic المحضرة من الفئران الوليدة P7 (بدء). الرموز تشير إلى تطبيق التماثلية ثيميدين، CldU *، و "العلاج"، والتي يمكن أن تشمل مختلف وكلاء الدوائية التي تناسب السؤال التجريبية. يتم إصلاحها الثقافات مع امتصاص العرق في أوقات يسكن المرجوة من تطبيق CldU (فيكس الثقافات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم الكاشف / معدات | شركة | عدد كتالوج | تعليقات / الوصف |
| 5-كلورو-2'-deoxyuridine (CldU) | النائب Biomedicals | 105478 | خطرة، مسرطن |
| إدراج ثقافة الخلية، 30 مم، 0.4 ميكرون صحجم خام | الحرارية العلمي | 140660 | Nuclon دلتا الطلاء على هذه إدراج يوفر أفضل التصاق الأنسجة ويحسن نوعية شريحة. |
| المخروطية الطرد المركزي أنابيب (عقيمة) | فيشر العلمية | 14-432-22 | |
| مقص مشرح (الزاوية إلى جنب) | أدوات العلوم غرامة | 14082-09 | |
| الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) | GIBCO | 11095. سائل | تخزينها في 4 ° C |
| كسوف ني-U المجهر الفلورسنت | نيكون | ||
| غراء للنسيج | كريزي الغراء | KG585 | استخدام الحد الأدنى للمبلغ من الغراء لتحقيق التصاق مثل أي نسيج تتعرض لالغراء ستكون غير صالحة للاستعمال لIHC. |
| محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) (500 مل) | GIBCO | 14025-092 | تخزينها في 4 ° C |
| الحصان المصل الحرارة المعطل (500 مل) | GIBCO | 16050-122 | جعل 50 مل مأخوذة وتخزينها في -20 ° C |
| Kimwipes | كيمبرلي كلارك | TW 31KYPBX | |
| الماصات الزجاجية المعدلة (أسفل ماصة باستير إزالتها وحافة ممهدة مع بنسن لهب) | |||
| طبق بتري (100 ملم × 15 ملم) و (60 مم × 15 مم) | فيشر العلامة التجارية | FB0875712 وFB0875713A | |
| شفرات المشرط # 11 | أدوات العلوم غرامة | 10011-00 | |
| مشرط مقبض # 3 | أدوات العلوم غرامة | 10003-12 | |
| الماصات المصلية | Sorfa الطبية شركة بلاستيك | P8050 | |
| ملقط نمط القياسية | أدوات العلوم غرامة | 11000-12 | |
| مرشح فراغ معقم | الحرارية العلمي | 565-0020 | |
| مقص جراحي | أدوات العلوم غرامة | 14054-13 | |
| حقنة مدفوعة حدة فلتر | ميليبور-Millex | SLGP033RS | |
| الأنسجة المروحية مع مرحلة المنقولة | Stoelting | 51425 | |
| طرف الفرشاة الجميلة |
الجدول 1. اللوازم والكواشف
| حل | المكونات والتعليمات |
| حل تشريح | أ) 500 مل من هانك و# 39؛ ق محلول الملح المتوازن (HBSS) (GIBCO-14025-092). |
| ب) إضافة 2.2 غرام D-الجلوكوز. | |
| ج) إضافة 0.5 غرام السكروز. | |
| د) إضافة 1.787 ز HEPES. | |
| ه) مزيج لمدة 30 دقيقة مع المغناطيسية لوحة ضجة. | |
| و) استخدام متر الرقم الهيدروجيني لضمان الحل والرقم الهيدروجيني النهائية = 7.4. | |
| ز) استخدام مقياس التناضح لضمان الأسمولية النهائية = 320-330 الميلي أسمول. | |
| ح) تعقيم الحل في معقم غطاء تدفق الصفحي باستخدام الترشيح فراغ من خلال 0.2 ميكرون التصفية. | |
| التي تحتوي على مصل مستنبت: 100 مل الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) (GIBCO 11095)، 50 مل مصل الحصان (GIBCO 16050-122)، 50 مل HBSS. | أ) إضافة ما يلي إلى 50 مل HBSS في كوب وتذوب في 37 ° C حمام الماء. خلط مع محرك مغناطيسي. |
| ب) 1.3 ز D-الجلوكوز. | |
| ج) 36 ملغ MgSO 4. | |
| د) 17.6 ملغ حامض الاسكوربيك. | |
| ه) 5 ميكرولتر من 2M CaCl حل 2 الأسهم. | |
| و) إضافة 50 ميكرولتر للمضادات الحيوية مضاد فطري (100X الأسهم، عقيمة، GIBCO 15140-062). | |
| ز) 1 ميكروغرام / مل الأنسولين. | |
| ح) تعقيم فوق الحل عن طريق الترشيح من خلال 0.2 ميكرون التصفية. | |
| ط) مزيج تصفيتها حل مع 100 مل MEM و 50 مل مصل الحصان في غطاء تدفق الصفحي. | |
| ي) تقديم 50 مل مأخوذة في العقيمة أنابيب الطرد المركزي المخروطية (فيشر العلمية 14-432-22) وتخزينها في 4 ° C. | |
| 4٪ محلول امتصاص العرق مثبت. | أ) إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وذلك بإضافة ما يلي إلى 300 مل من H 2 O المقطر والاختلاط على المغناطيسية لوحة ضجة. |
| ب) إضافة 2.7 غرام فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (ناه 2 PO 4). | |
| ج) إضافة 11.5 غرام الفوسفاط الصوديومالبريد ثنائي القاعدة (NaHPO 4). | |
| د) إضافة 9.0 غرام كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم). | |
| ه) سخني تقريبا. 700 مل من H 2 O المقطر إلى 55 درجة مئوية وإيقاف الحرارة. | |
| و) اضافة 40 غ بارافورمالدهيد (PFA) ويقلب في 700 مل من الماء باستخدام المغناطيسية لوحة ضجة. | |
| ز) الجمع بين PBS (أ، ب، ج، د) وPFA (ه، و) الحلول، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وأعلى ما يصل إلى الحجم النهائي من 1،000 ملم. | |
| 0.1٪ أزيد الصوديوم الحل | أ) اضافة 1G من مسحوق أزيد الصوديوم (نان 3) إلى 1 L من حل PBS. |
| ب) مزيج باستخدام لوحة تحريك مغناطيسي وتخزينها في 4 ° C. |
الجدول 2. حلول وصفات
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وبعد CldU (أو BrdU) الإدارة، وجدول زمني لتطبيق كلاء الدوائية ويمكن اختيار لاستهداف DGCS حديثي الولادة خلال معينة النوافذ التنموية. على سبيل المثال، وكيل افتراضية يمكن تطبيقها خلال الأسبوع الثاني الحقن بعد CldU، والذي يقترح ليتزامن مع عمر الخلايا العصبية غير الناضجة التي هي في مرحلة التطوير حيث يتم إزالة إستقطاب GABA. يمكن أن الدراسات المستقبلية باستخدام هذا البروتوكول التكيف مع وكيل الدوائية ونافذة من التعرض ل"خياط" النهج على سؤال تجريبي محددة من الفائدة.
معيارا هاما لتحديد أن الثقافات شريحة هي نموذجا صالحا للبحث تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة هو القدرة على تحديد الخلايا العصبية وصمة عار وحديثي الولادة في قرن آمون. وكانت النتائج الرئيسيان في دعم هذه الفرضية أن التحليل المجهري كشف التفاعل المناعى للCldU وعلامات البروتين الذاتية في نفس الخلايا العصبية.عندما تستخدم بالاقتران مع علامات العصبية الذاتية، نظائرها ثيميدين مثل BrdU وCldU هي أدوات قوية للبحوث الخلايا العصبية.
ويستخدم تطبيق نظائرها ثيميدين، مثل BrdU، عن طريق الحقن داخل الصفاق عادة في البحوث تكوين الخلايا العصبية للخلايا العصبية التسمية تمر S-مرحلة من الانقسام 29. نهج مماثلة يمكن استخدامها في الثقافات عضوي النمط مع بعض التعديلات. على سبيل المثال، والدراسات السابقة تدار BrdU (0.5 ميكرومتر لمدة 3 أيام) لشريحة الثقافات بعد ~ 14 DIV 18. مراجعة البيانات المقدمة في تلك الورقة يكشف عن أن بعض المقاييس المستخدمة لقياس تكوين الخلايا العصبية لا توظف التقنيات القياسية المستخدمة في مجال تكوين الخلايا العصبية، أي الكمي stereological 30. على سبيل المثال، عند الإبلاغ المشارك التعبير عن BrdU والعصبية-نوى (NeuN) خلايا إيجابية، فإنها تشير إلى العدد الكلي للخلايا "في الثقافة" بدلا من تقديم إعلامأوجه بشأن منطقة الأنسجة أو حجم.
تحسنت دراسات لاحقة على هذه الطريقة من قبل باجتزاء شرائح مثقف إلى الفردية 10 ميكرون أقسام، مما أدى إلى تحسن التصور والمناعية البروتوكولات من خلال السماح الأجسام المضادة لتتخلل بسهولة أكبر عينات الأنسجة 31. كلام فارغ وآخرون 28 أفادت وضع العلامات مزدوج مع BrdU (10 ميكرومتر لمدة 3 أيام)، وعدد الخلايا المسمى شارك في 10 ميكرون القسم، ولكنها لم تقدم معلومات عن المنطقة المقارنة أو منطقة قرن آمون محددة درس أي CA1، CA3 أو DG. بالإضافة إلى ذلك، لا يظهر تحليل مبائر ومضان الصور المجهري مقنع أن التشكل الحصين قد حافظت بنجاح.
الأهم من ذلك، تستخدم كلتا الدراستين فترة التعرض BrdU من 3 أيام، والذي يرتبط عيوب. وضع العلامات BrdU وقد ساعد الى حد كبير دراسات تكوين الخلايا العصبية عن طريق السماح للمحققين لتعقب خلايا تنقسم حديثا في فامناطق الدماغ rious زارة. ومع ذلك، BrdU سمية كما تميزت أيضا. وقد تبين استخدامه لإحداث تشوهات شكلية والسلوكية 32،33 وآثار سلبية على دورة الخلية، والتمايز، والهجرة والبقاء على قيد الحياة من الخلايا الجذعية العصبية 34-36. إدارة لفترات طويلة من BrdU في الدراسات التي سبق ذكرها قد أدخلت المتغيرات التباس غيرت علم وظائف الأعضاء الحصين وبينما بعض الآثار الجانبية من إدارة BrdU قد يكون لا مفر منه، وقد تم تصميم بروتوكول تجريبي لدينا للحد من بعض هذه المضاعفات التي يحتضنها الأنسجة مع نظائرها ثيميدين ل 2 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، اخترنا لاستخدام CldU بدلا من BrdU لأنها أظهرت الذوبان أفضل من BrdU عند إعداد الحل يحتضنها. على الرغم من أن بروتوكول 3 اليوم قد تكون مفيدة لبعض تصاميم تجريبية على سبيل المثال، وتعظيم بوضع العلامات على الخلايا المتكاثرة، هذا البروتوكول ساعة 2 لديه ميزة من نبض وضع العلامات من شعبية صغيرة نسبيانشوئها من الخلايا التي يمكن دراستها في أوقات بقاء المطلوبة (انظر الشكل 2B).
من خلال مقارنة مستوى الإنتاج العصبية التالية طريقتين مختلفة من تطبيق BrdU، نامبا وآخرون قدموا مساهمة هامة لتقنيات وضع العلامات في الثقافات شريحة عضوي النمط 37. المؤلفين داخل الصفاق مقارنة (IP) حقن BrdU (50 ملغ / كلغ) في يوم ما بعد الولادة 5 (P5) مع الفئران في المختبر الثقافات التي تلقت مستنبت تحتوي على 1 BrdU ميكرومتر لمدة 30 دقيقة على الفور فيما يلي explantation من الأنسجة. وأفاد الباحثون الفرق لا يعتد به إحصائيا بين في الجسم الحي وأوائل في المختبر BrdU الحقن في أنسجة مثقف. مقدمي البلاغ لم يقدم صورا واضحة تحدد هيكل الحصين لكنهم تقرير مناعية BrdU كنسبة مئوية من مجموع الخلايا في طبقة الخلايا الحبيبية. في حين أنها توظف العد stereological، من شأنه أن يوفر قدرا من حيث المساحة أو الحجم تكون ذات قيمة. بشكل عام، الدراسات المذكورة الثقافات عضوي النمط الحالية كما يفصل دقيق من بعد الولادة الثقافات شريحة الحصين، مع تطبيقات لدراسة تكوين الخلايا العصبية والاضطرابات الدوائية. باستخدام هذه التقنية، وشرائح قرن آمون يمكن الحفاظ لمدة تصل إلى 21 يوما في المختبر (DIV) والعقاقير يمكن أن تضاف إلى متوسطة في أي نقطة في الفترة الثقافة لدراسة تأثير على تكوين الخلايا العصبية.
كان هدفنا هو تسمية منفصلة، والسكان متجانسة نسبيا من DGCS من خلال توفير "نبض" تطبيق وجيزة من CldU لمدة 2 ساعة. إحدى الاستراتيجيات استخداما لدراسة تكوين الخلايا العصبية وتتضمن تحديد مرحلة يجرونها على العصبون عبر تلطيخ المناعى لمختلف علامات الذاتية مع التناظرية ثيميدين. وأكد متحد البؤر ومضان المجهري وجود نوى أن إدراج CldU ثيميدين التناظرية، وبالتالي كانت تمر بنشاط الانقسام خلال الفترة الثقافة. الشكل 2 الأنسجة في الجسم الحي يمكن تكييفها لشريحة الثقافات.
على وجه التحديد، وهي طريقة تستخدم عادة في البحوث تكوين الخلايا العصبية هو لأداء تلطيخ المناعى للأنيبيب المرتبطة بروتين، DCX، وهو ما يعبر عنه في الغالب في الخلايا العصبية غير ناضجة من يوم 3-21 وعلامة العصبية الناضجة، Calbindin (CaBP)، وهو ما يعبر عنه تماما التالية 28 يوما بعد الانقسام. تم تحديد النمط الظاهري للخلايا CldU + باستخدام هذه العلامات الذاتية 26.
تحسين طرق للحفاظ على الثقافات شريحة لفترات أطول قد يكون فائدة إضافية تتمثل في السماح لمزيد من CldU + الخلايا العصبية للوصول إلى ناضجة، CaBP + المرحلة. في الوقت الحاضر، الحد من نهج ثقافة عضوي النمط هو أن الأنسجة يتغير بشكل مستمر خلال الفترة الثقافة. على سبيل المثال، مباشرة بعد تشريح الحصين والطلاء من شرائح، ومنظمة الشفافية الدوليةssue لديها يبلغ عرضه نحو 400 ميكرون. ومع ذلك، وبعد 2-3 أسابيع في غرفة الحضانة، وسوف تبدأ شرائح الأنسجة رقيقة، مما يؤدي الى العرض النهائي بين 250-350 ميكرون. وهذا يحد من كمية الأنسجة التي يمكن استخدامها لالمناعية، وينبغي أخذها في الاعتبار عند التخطيط لكيفية العديد من الحيوانات لاستخدامها لهذا المشروع. سوف تجارب إضافية تساعد تميز التغييرات الوظيفية في علم وظائف الأعضاء قرن آمون التي تحدث في المختبر.
وقد تم تطوير بروتوكول لباجتزاء وتلطيخ شرائح الحصين لتحليل التغيرات الخلوية والمورفولوجية التي تحدث خلال فترة زراعة. توفر شريحة الثقافات فرصة لاختبار تأثير مختلف وكلاء الدوائية كما DGCS الحصين تمر عبر مراحل نمو متميزة خلال النضج وتمثل أداة قيمة للدراسات تكوين الخلايا العصبية الكبار في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A.
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H.
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
