Summary
Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese mit dem organotypischen Kulturtechnik. Dieses Verfahren ermöglicht die in vitro Manipulation von Neurogenese und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen an die kultivierten Hippocampus.
Abstract
Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese im Gehirn von Nagetieren mit dem organotypischen Kulturtechnik. Diese Methode behält die charakteristische topografische Morphologie des Hippocampus und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Mitteln für die Entwicklungs Gyrus dentatus des Hippocampus. Zusätzlich können Gewebekulturen für bis zu 4 Wochen aufrechterhalten werden, und somit erlauben, die Reifung von neugeborenen Körnerzellen zu untersuchen. Schnittkulturen ermöglichen eine effiziente pharmakologische Manipulation von hippocampalen Schnitten unter Ausschluss komplexen Variablen wie Unsicherheiten in den tiefen anatomischen Lage des Hippocampus sowie der Bluthirnschranke stehen. Aus diesen Gründen haben wir versucht, organotypischen Kulturen für postnatale Neurogenese Forschung gezielt zu optimieren.
Protocol
HINWEIS: Alle Tierverfahren gemäß den zum Tiergesundheit und Tier Richtlinien der Abteilung für Vergleichende Medizin an der Universität von Toronto.
1. Herstellung von Schnitten des Hippocampus
- Sterilisieren Sie die folgenden Instrumente mit dem Trocken Autoklaven bei 125 ° C: Skalpellgriff (# 3) (2), Standard-Muster Pinzetten, groß (1), Kleine Dissektor Scheren (abgewinkelt zu Seite) (1), Micro Löffel (Löffel und Flach Spachtel Enden) (1), Mikro-Spatel (abgerundet und aufgerundet verjüngten Enden) (2), Gourmet Pinsel (1), poliert Feuer Pasteur-Pipette (2), Gaze Plätze, 2 x 2 Zoll (5).
- Wenn sterile, legen Sie die Instrumente in einen sterilen Behälter und halten bis zum Gebrauch überdachte. Unmittelbar vor der Dissektion, tauchen Instrumente in einer 70% igen Ethanollösung.
- Bereiten Sie eine 6-Well-Kulturplatte mit Kultureinsatzes vor Beginn der Dissektion Verfahren durch Zugabe von 1 ml Kulturmedium / Vertiefung und Speichern der Platte in den Inkubator bei 35 ° C einnd 5% CO 2.
2. Ordnen Sie Dissection Werkzeuge in sterilen Laminarströmungshaube
- Sprühen Sie das Steril mit 70% Ethanol und entfernen sterilisiert Dissektionsinstrumente von Alkohol. Ermöglichen, dass die Instrumente zu trocknen, während auf eine sterile Petrischale ruhen, um den Kontakt zwischen dem Alkohol und dem sezierten Hirngewebe zu vermeiden.
- Kaution 5-7 ml sterilisiertem eiskalten Sezieren Lösung in 2 große sterile Petrischalen. Ein Gericht wird zu kühlen und reinigen Sie den Kopf (dirty), die andere zum Kühlen und Spülen der ausgehöhlt Gehirn (clean). Platzieren eines sterilisierten Filterpapier in einer Petrischale Deckel zum Zerlegen das Gehirn.
- Legen Sie eine kleine, sterilisierte Filterpapier in einem der kleinen Petrischale Deckel zum Präparieren Sie das Hippocampus. Kaution 3-5 ml sterilisiertem eiskalten Sezieren Lösung in 2 kleine, sterile Petrischalen. Ein Gericht wird den ausgehöhlt Hippocampus zu halten, wird man Abschnitte während der Abtrennung des Hippocampus Abschnitte haltenunter Dissektionsmikroskop.
- Bereiten Sie das Gewebe Chopper durch Abkleben ein Stück Filterpapier sterilisiert an die Schneidphase und Montage einer sterilen Rasierklinge. Befeuchten Sie das Filterpapier mit sterilisierten Sezieren Lösung.
- Sprühen Sie eine saubere Bio-Beutel mit Alkohol und legen Sie sie in eine laminare Strömung Sterilbank.
3. Hippocampus Dissection
- Sprühen Sie das P7 Sprague-Dawley Rattenjungen mit 70% Ethanol außerhalb der laminaren Strömung Sterilbank und schnell zu enthaupten, das Tier mit großen sterilen chirurgischen Schere in der Sterilbank. Lassen Sie den Kopf fallen in eiskaltes Sezieren Lösung in einem der Petrischalen.
- In der Petrischale, spülen Sie das Blut und schnell überweisen Sie den Kopf zu sterilisierende Filterpapier, Bauchseite nach unten.
- Verwendung des Skalpell entlang der Rückenfläche in der sagittalen Ebene schneiden die darunterliegende Schädel freizulegen. Schnitt durch die Haut, aber nicht die darunter liegenden Knochen, die weich und bei Ratten t leicht durchlässig istsein Alter. Beiseite dieses "dirty" Skalpell und nicht auf Hirngewebe zu verwenden nicht.
- Mit den kleinen Dissektor Schere (abgewinkelt zu Seite) und Zangen, aufgeschnitten den Schädel entlang Pfeilnaht des Schädels zu Bregma, die anatomische Punkt auf dem Schädel, wo die Kranznaht senkrecht durch die Pfeilnaht durchschnitten. Verwenden einer Pinzette, um Schädel Klappen von der Mittellinie des Schädels auf und davon ziehen.
- Setzen Sie den Mikrolöffel an der Unterseite des Gehirns, unter der Hirnstamm, zu heben, das Gehirn aus dem Schädel. Heben Sie das Gehirn, um die Sehnerven und Riechkolben auf die basale Oberfläche des Gehirns aus. Schneiden Sie diese Strukturen mit einer kleinen Schere vollständig zu lösen, die das Gehirn vor den Schädel. Entfernen Sie und übertragen Sie die intakten Gehirn auf die andere große Petrischale mit eiskaltem Sezieren Lösung.
- Mit dem Mikrolöffel, übertragen das Gehirn auf eine kleine Petrischale Deckel, die steriles Filterpapier. Mit einer sterilen Pasteurpipette gründlich das Gehirn mit ein paar Tropfen disschneidenden Lösung, um Gewebe feucht zu halten.
- Mit Hilfe eines "sauberen" Skalpell schneiden die beiden Halbkugeln auseinander. Übertragen Sie die linke Hemisphäre wieder in großen Petrischale mit Mikrolöffel und legen Hemisphäre pia Seite nach unten in eiskaltem Sezieren Lösung für die spätere Verwendung.
- Sehen Sie sich die medialen Fläche des rechten Hemisphäre und Identifizierung der Randgewölbe, eine herausragende Band aus weißen Substanz entlang der medialen Rand des Hippocampus. Mit einem sterilen Skalpell, einen sagittalen Schnitt durch das Scheidengewölbe, aber darauf achten, denn nur 0,5 cm des Skalpells Spitze wird ausreichen, um den Fornix schneiden.
- Mit 2 Mikro-Spatel, entfernen Sie die ersten Hippocampus vom rechten Hemisphäre, indem Sie den rechten-Spatel auf den Hirnstamm und Anheben des darüber liegenden Kortex mit der linken Spachtel. Heben Sie die Rinde, die Seitenventrikel und mediale Fläche des Hippocampus zu offenbaren. Eine weiße geschwungene Linie, die Fimbria, sollte jetzt sichtbar sein.
- Richten Sie die Krümmung der Spatel mit der Curvatur der Fimbrien und vorsichtig auf die Spachtel unter der Fimbrien. Schieben Sie den Spatel nach links und fahren Sie entlang rostral-kaudale Achse und heben Spachtel in dorsale Richtung Hippocampus zu entfernen.
- Übertragen Sie den Hippocampus zu einem 2. kleinen Petrischale mit eiskaltem Sezieren Lösung. Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Hemisphäre, um den linken Hippocampus zu entfernen.
- Mit einem Mikrospatel, sorgfältig die hippocampi Transfer zum Gewebe Chopper Bühne. Ordnen sie benachbart und parallel zueinander und senkrecht zu der Achse der oszillierenden Klinge. Verwenden Sie einen Pinsel, um das Gewebe zu positionieren und ein paar Tropfen des Präparationslösung auf der Oberseite des Hippocampus.
- Schneiden Sie das Gewebe in 400 & mgr; m Scheiben ohne Pause zu einzelnen Scheiben zu entfernen (in der Regel werden sie nicht an der Klinge haften). Nach den ganzen Hippocampus geschnitten worden ist, verwenden Sie den Pinsel, um vorsichtig zu übertragen die Abschnitte zu einem 2. kleinen Petrischale mit Dissektion Lösung.
- Unter Anzeigeissecting Mikroskop vorsichtig trennen die schwimmenden Scheiben mit amicro-Spachtel und Pinsel.
- Entfernen Sie die vorbereiteten Kulturplatte mit Kultureinsatzes aus dem Inkubator und in eine Sterilbank.
- Mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette, ziehen 4-5 Scheiben in die Pipette und Transfer Scheiben an die apikale Oberfläche der Kultureinsatzes Membran. Als nächstes stellen Sie die Position mit einem Pinsel und lassen Raum zwischen einzelnen Abschnitte und der Grenze des Kultureinsatzes.
- Mit einer sterilen Pasteur-Pipette, entfernen Sie das überschüssige Sezieren Lösung von apikalen Oberfläche der Membran.
HINWEIS: Beim Entfernen Lösung vermeiden Zeichnung Gewebeschnitte in die Pipette. Alternativ können Sie einen regelmäßigen Pipette (P200 oder P1000) mit sterilisierten Pipettenspitzen langsam entfernen Lösung. - Platzieren der Kulturplatte mit serumhaltigem Kulturmedium und den Hippocampus wieder in den Inkubator bei 35 ° C und 5% CO 2.
HINWEIS: Wenn Experiment Anrufezur Erzeugung von Kulturen aus verschiedenen Tieren, gründlich zu reinigen die laminare Strömung Sterilbank zwischen Dissektionen. Zurück Instrumente Alkohollösung und ersetzen Sie alle Petrischalen, Filterpapiere und sterilen Rasierklingen vor der zweiten Sektion.
4. Fütterung und Pflege von organotypischen Slices
- Futterkulturen in einem sterilen laminaren Strömung Sterilbank.
- Führen Sie die erste Fütterung der kultivierten Abschnitten 2 Tage nach der Präparation. Saugen Sie alte Kulturmedium unter Verwendung sterilisiert Glaspipette.
- Sterile 5 ml serologische Pipette 1 ml frisches, steriles, Serum enthaltendem Medium zu den Vertiefungen hinzu.
- Ersetzen Sie vorsichtig die Kultureinsatzes und kümmern uns um die Luftblasen, die unter Membranoberfläche gebildet haben können.
- Nach der ersten Fütterung, jeden zweiten Tag geändert Medium.
5. Inkubation von Gewebeschnitten mit Thymidin-Analoga zu Newborn Neuronen Beschriften
- Um zu untersuchen,die Reifung und Integration von dentatus Körnerzellen im Hippocampus, brüten die organotypische Scheiben mit einer Thymidinanalogon wie Bromodeoxyuridine (BrdU) oder Chlorodeoxyuridine (CldU). Hier verwenden wir CldU aufgrund seiner höheren Löslichkeit in Salzlösung.
- Nach 3DIV wird mit 1 ul 10 mg / ml Stammlösung CldU in Kochsalzlösung auf 1 ml Kulturmedium bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml. Wenn BrdU verwendet wird, korrigieren Sie die Konzentration für die Unterschiede im Molekulargewicht. Hinzufügen Medium mit CldU Kultur Vertiefungen inkubieren Gewebes mit CldU haltige Medium für 2 Stunden bei 35 ° C.
- Nach 2 Stunden Inkubation bei 35 ° C, entfernen Sie die CldU haltigen Mediums und Ersetzen mit regulären Fütterungsmedium zur normalen Ernährungsplan (siehe oben) wieder aufzunehmen.
6. Gewebefixierung und Lagerung
- Stellen Sie einen Zeitplan für die Anwendung Behandlungen und Befestigungsgewebeproben vor Beginn der Kulturexperimenten (2B). <li> Bei einem vorbestimmten Tag nach der Dissektion, bereiten Sie die folgenden in einem Laborabzug: a 10-50 ml Becherglas mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS); ein leeres Becherglas verworfen Kulturmedium; kleine Zange; und ein 1.000 ml-Pipette mit Einwegspitzen.
- Entfernen Sie die Kulturplatte (n) aus Inkubationskammer und Transfer zu einem Abzug. Kippen Sie die einzelnen Well-Platte Einsätze mit einer Pinzette. Als nächstes mit einer Pipette Kulturmedium und in ein Becherglas zur Verfügung zu entfernen. Schwenk der Kulturplatte in einem Winkel, um sicherzustellen, dass alle Kulturmedium entfernt.
- Beenden Entfernen Medium für eine Kulturplatte zu einer Zeit. Als Medium wurde entfernt, 1 ml von 4% PFA zu jeder Kultur gut und Siegel gut mit Parafilm zu plattieren. Wiederholen für so viele Kulturplatten als notwendig und Übertragungsplatten in den Kühlschrank bei 4 ° C für 24 Stunden.
- Nach 24 Stunden, bereiten Sie die folgenden in einem Abzug: 10-50 ml Becherglas mit 0,1% Natriumazid in PBS; eine leereBecherglas verworfen PFA (folgen Sie Sicherheitsvorkehrungen, wenn das Verwerfen giftige Stoffe); kleine Zange; und 1000 ml-Pipette mit Einwegspitzen.
- Gehen Sie wie unter 6.4 für das Hinzufügen von PFA umrissen, aber 1 ml PBS mit Natriumazid statt. Einmal vollständig übertragen, Dichtungs Mikrotiterplatten für die zukünftige Verwendung durch Umwickeln Kanten in Parafilm und Lagerung im Kühlschrank bei 4 ° C.
7. Schnitte Gewebe für die Immunhistochemie
- Führen Schneiden mit einem Vibratom Gewebe. Die folgende Reihe von Schritten zur Maximierung der Ausbeute an verwertbarem Gewebeschnitte von organotypischen Kulturen.
HINWEIS: Unmittelbar im Anschluss an hippocampale Dissektion und beschichteten Scheiben, hat das Gewebe eine Dicke von etwa 400 um. Jedoch nach 2-3 Wochen in der Inkubationskammer werden Gewebeschnitte beginnen zu glätten, was in einem letzten Abschnitt Dicke von 150-300 & mgr; m. - Bereiten Sie Folgendes vor dem Kapitel gezüchtete Gewebe: ein # 11 Skalpell blade und Griff, eine Glaspetrischale mit eiskaltem PBS, eine Mikrodissektion Zangen, und eine saubere Schnitt Vibratom Bühne, um Gewebe zu befestigen.
- Verwenden ein Skalpell vorsichtig entlang des Umfangs des kreisförmigen Einsatz Membran geschnitten, so dass sie von den Kunststoffeinsatz Gehäuse gelöst werden. Lassen Sie genügend Raum zwischen der kultivierten Scheibe und dem Skalpell.
- Übertragen Sie die freistehende Einsatz Membran auf eine Petrischale mit PBS. Nach dem Spülen in PBS verwenden Zange, um die Membran zu der Vibratom Montagetisch zu übertragen.
- Als Nächstes verwenden Sie das Skalpell, um überschüssige Membran umgibt kultivierten Scheiben zu beseitigen und schneiden Sie überschüssiges Material um saubere Kanten zu schaffen. Dieser Schritt wird die Membran sicherzustellen ist flach und kann leicht an der Schnittfläche entsprechen.
- Zeigen 1-2 Tropfen Kleber auf der Vibratom Schneid Bühne und verteilt in gleichmäßige Schicht mit einer 22 G-Nadel. Verbreiten Klebstoff in einer rechteckigen Form mit der langen Seite parallel zu der Schneidklinge der Vibratom. Führen Sie diesen Schrittschnell, um den Klebstoff vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Verwenden einer Pinzette, um das zugeschnittene Membran, die Hippocampus-Schnitten an der Schneidphase zu übertragen und vorsichtig positionieren Sie die Membran auf Kleber und sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen.
- Wie der Sekundenkleber trocknet, übertragen Sie die Vibratom Bühne mit dem Klebemembran zurück in die PBS, die Petrischale. Bereiten Sie die Vibratom Klinge und eine 48 Well-Platte mit Natriumazid, um Gewebeschnitte zu speichern.
- Verwenden Sie die Vibratom bis 30 um Abschnitte der organotypischen Gewebe und in ein 48-Well-Platte, die Natriumazid enthalten, abgespeichert und dann immunhistochemischen Färbung zu erzeugen.
- Siehe Protokolle zur immunhistochemischen Färbung 26,29 vorbestehenden.
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Representative Results
Feststellen, ob organotypischen Kulturen wäre geeignet für adulte Neurogenese Forschung erforderlich, dass sie zwei Hauptkriterien erfüllen: 1), dass Scheiben halten charakteristischen morphologischen Merkmale der Hippocampus nach 10-21 Tagen in vitro (DIV), und 2) dass neugeborene DGCs quantifiziert werden mit Standard-immunhistochemischen Techniken, die üblicherweise in der adulten Neurogenese Forschung beschäftigt. In Bezug auf das erste Kriterium, 1A und 1B markieren Sie den erhaltenen Hippocampus Morphologie. Charakteristische Merkmale wie der Gyrus dentatus (DG), CA1 und CA3 Regionen sind leicht zu identifizieren.
Bezüglich des zweiten Kriteriums, 1C (oben) stellt eine repräsentative Stichprobe von Neugeborenen DGCs Co-Expression des endogenen neuronalen Marker, Double (DCX) in Grün und die exogene Thymidinanalogon, 5-Chlor-2'-Desoxyuridin (CldU) in rot. Diese Neuronen sind in dem Unter gr befindetringförmigen Zone des Hippocampus DG. Um eine korrekte Geburt aus der Neuronen sorgen identifizieren wir CldU + Kerne, die DCX-ausdrücken co. Die konfokale Mikroskopie wird in dieser Phase benötigt, um erfolgreich zu identifizieren doppelt markierten Neuronen weil Kandidatenzellen müssen co-exprimieren den Marker von Interesse in der Z-Achse der Zelle. Probendaten mit solchen Doppelmarkierungs Ausbeute ca. 17% der CldU + Zellen, DCX und 35% der CldU + Zellen, CaBP bei 12 Tagen nach CldU Anwendung ausgedrückt. Der DCX-Wert ist sehr ähnlich, während die CaBP Wert ist erheblich niedriger als Vergleichswert in vivo 26 erhalten. Standard-Zellkulturbedingungen kann für einen relativ geringen Prozentsatz der CaBP + Zellen verantwortlich sein.
2A stellt die Dissektion Schritte, die von links nach rechts (1-8) vor: mit Enthauptung des Tieres (1), die Entfernung von Gehirn (2), Transfer von Gehirn zu eiskalten Sezieren Lösung (3), sezierenIon des Hippocampus von links und rechten Gehirnhälfte (4), die Lagerung von seziert hippocampi in eiskaltem Sezieren Lösung (5), die Übertragung beider hippocampi zu Stölting Gewebe Chopper und Schneiden bei 400 & mgr; m (6), die Trennung von einzelnen Scheiben unter Binokular (7) und Plattieren Gewebe auf Zellkultur-Einsätze (8). Ausgehend auf diese Weise hilft, eine sterile Umgebung in der gesamten Kulturverfahren.
Schließlich, da der zeitliche Verlauf der Entwicklung ist ein wichtiges Merkmal der Neurogenese, entschieden wir uns, um die kultivierten Scheiben mit CldU genau 2 Stunden nach 3 DIV Etiketten Teilung neuraler Stammzellen inkubiert. Der enge Zeitfenster für CldU Verabreichung wurde ausgewählt, um die Wahrscheinlichkeit, dass Neuronen gebildet eine homogene Population von Zellen zu ungefähr derselben Reifungsstufe (2) markiert verbessern. Im Hinblick auf die CldU Kennzeichnung, ist eine kritische Funktion der Neurogenese zur Hippocampus-Funktion, dass bei einer given Zeit gibt es eine heterogene Population von dentatus Körnerzellen in verschiedenen Reifungsstadien 27,28.
Abbildung 1. Beispielfluoreszenzmikroskop Aufnahmen Hervorhebung erhalten Hippocampus Morphologie. (A) Organotypischen 12 Tage nach der Präparation für CldU (grün) und CaBP (rot), 20x Luft zusammengesetzte Bild immun (Maßstabsbalken = 500 um). (B) Probenmikroskopische Aufnahme Scheibe ab 21 Tage nach der Präparation für CldU immun ( rot) und DCX (grün) (gegenüber Farbschema von Abbildung 1A), 20x Luft (Maßstabsbalken = 100 um). (C) Oberes Feld. Vertreter konfokalen Mikroskop Foto von Zellen co-exprimierenden ClXdU und endogene unreifen neuronalen Marker, DCX. DGCs coexprimieren DCX (grün) und CldU (rot) als neugeborenen Nervenzellen gezählt. Der Pfeil zeigt eine zwei labegeführt Zelle in einem frühen Stadium der Entwicklung, 40X Ölimmersions (Maßstabsbalken = 10 um). Vergleichbare Zellen in vivo 26 beobachtet 10 Tage nach der Markierung. Das untere Feld. Repräsentative Fluoreszenzbilder der Zellen zur Co-Expression CldU (grün) und CaBP (rot). Der Pfeil zeigt einen doppelt markierten Zellen, 40X Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme (Maßstabsbalken = 10 um). DG-Gyrus dentatus. GCL-Körnerzellschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. (A) Darstellung der aufeinanderfolgenden Schritten zur Hippocampus-Dissektion in Laminar-Flow-Sterilbank. Gepunktete Linie zeigt "unsteril" (links) und "steril" (rechts) Zonen der Dissektion Bereich. (B) Zeitleiste für Organotypic Schnittkulturen von P7 Rattenjungen (Start) vorbereitet. Notationen zeigen Anwendung Thymidinanalogon, CldU * und "Behandlung", die verschiedene pharmakologische Mittel der experimentellen Frage geeignet sind, umfassen kann. Die Kulturen werden mit Paraformaldehyd in gewünschten Verweilzeiten von CldU Anwendung (Fix Kulturen) festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| Name des Reagenz / Ausrüstung | Unternehmen | Katalog-Zahl | Kommentare / Beschreibung |
| 5-Chlor-2'-Desoxyuridin (CldU) | MP Biomedicals | 105.478 | Gefährliche, Karzinogene |
| Zellkultur-Einsätze, 30 mm Durchmesser, 0,4 um pErz Größe | Thermo Scientific | 140.660 | Nuclon Delta-Beschichtung auf dieser Einsätze eine bessere Gewebeadhäsion und verbessert die Scheibenqualität. |
| Konische Zentrifugenröhrchen (steril) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector Schere (abgewinkelt zu Seite) | Fine Science Tools | 14.082-09 | |
| Minimalmedium (MEM) | Gibco | 11.095; Flüssigkeit | Lagerung bei 4 ° C |
| Eclipse-Ni-U Fluoreszenzmikroskop | Nikon | ||
| Klebstoffe für Gewebe | Krazy Glue | KG585 | Verwenden Minimum an Klebstoff, um die Haftung zu erzielen als jedes Gewebe zu kleben ausgesetzt unbrauchbar für IHC sein. |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Lagerung bei 4 ° C |
| Pferdeserum hitzeinaktiviertem (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Stellen Sie 50 ml Teilmengen und bei -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Geändert Glaspipetten (Unterseite des Pasteur-Pipette entfernt und Kante mit Bunsenflamme geglättet) | |||
| Petrischale (100 mm x 15 mm) und (60 mm x 15 mm) | Fisher Marke | FB0875712 und FB0875713A | |
| Skalpellklingen # 11 | Fine Science Tools | 10.011-00 | |
| Skalpellgriff # 3 | Fine Science Tools | 10.003-12 | |
| Serologische Pipetten | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard-Muster Pinzetten | Fine Science Tools | 11.000-12 | |
| Sterile Vakuumfilter | Thermo Scientific- | 565-0020 | |
| Chirurgische Schere | Fine Science Tools | 14.054-13 | |
| Spritze angetrieben Filtereinheit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue Chopper mit beweglichen Bühne | Stölting | 51.425 | |
| Feine Spitze Pinsel |
Tabelle 1 Zubehör und Reagenzien
| Lösung | Zutaten und Anleitung |
| Dissection Lösung | a) 500 ml von Hank &# 39; s Balanced Salt Solution (HBSS) (Gibco-14.025-092). |
| b) In 2,2 g D-Glucose. | |
| c) In 0,5 g Saccharose. | |
| d) In 1,787 g HEPES. | |
| e) Mischen Sie 30 Minuten mit Magnetrührplatte. | |
| f) Verwenden Sie pH-Meter, um Lösung zu gewährleisten hat ein End-pH-Wert von 7,4. | |
| g) Verwenden Sie Osmometer zu Endosmolalität = 320-330 mOsm gewährleisten. | |
| h) Sterilisieren Lösung steril Sterilbank mit Vakuumfiltration durch 0,2 um Filter. | |
| Serumhaltigem Kulturmedium: 100 ml Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco 11095), 50 ml Pferdeserum (Gibco 16.050-122), 50 ml HBSS. | a) Fügen Sie den folgenden 50 ml HBSS im Becher und im 37 ° C Wasserbad auflösen. Mischen Sie mit Magnetrührer. |
| b) 1,3 g D-Glucose. | |
| c) 36 mg MgSO 4. | |
| d) 17,6 mg Ascorbinsäure. | |
| e) 5 ul 2 M CaCl2 Stammlösung. | |
| f) In 50 ul Antibiotika-antimykotische (100x Stock, steril; Gibco 15140-062). | |
| g) 1 & mgr; g / ml Insulin. | |
| h) Sterilisieren obigen Lösung durch Filtration durch einen 0,2 um Filter. | |
| i) Mix filtrierte Lösung mit 100 ml MEM und 50 ml Pferdeserum in Sterilbank. | |
| j) Stellen 50 ml Aliquots in sterilen konischen Zentrifugenröhrchen (Fisher Scientific-14-432-22) und bei 4 ° C. | |
| 4% Paraformaldehyd Fixierlösung. | a) Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durch Zugabe der folgenden zu 300 ml destilliertem H 2 O und Mischen auf Magnetrührplatte. |
| b) In 2,7 g Natriumdihydrogenphosphat (NaH 2 PO 4). | |
| c) In 11,5 g Natrium-Phosphate zweibasigen (NaHPO 4). | |
| d) In 9,0 g Natriumchlorid (NaCl). | |
| e) Erhitzen Sie ca. 700 ml destilliertem H 2 O bis 55 ° C und schalten Sie Wärme. | |
| f) In 40 g Paraformaldehyd (PFA) und rühren in 700 ml Wasser mit Magnetrührplatte. | |
| g) Kombinieren Sie den PBS (a, b, c, d) und PFA (e, f) Lösungen, den pH-Wert auf 7,4 und Öl bis zur endgültigen Volumen von 1.000 ml. | |
| 0,1% Natriumazid-Lösung | a) 1 g pulverisiertes Natriumazid (NaN 3) In den 1 l PBS-Lösung. |
| b) Mix mit Magnetrührplatte und bei 4 ° C. |
Tabelle 2. Lösungen und Rezepte
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Discussion
Nach CldU (oder BrdU) Verabreichung kann die Zeitleiste der Anwendung von pharmakologischen Mitteln ausgewählt werden, um neugeborene DGCs während bestimmter Entwicklungs Fenster Ziel. Zum Beispiel kann eine hypothetische Mittel während der zweiten Woche nach der CldU Injektion, die vorgeschlagen wird, mit dem Alter der unreifen Neuronen, die zu einem Entwicklungsstadium sind, wo GABA depolarisierende übereinstimmen angewendet werden. Zukünftige Studien unter Verwendung dieses Protokolls kann die pharmakologische Mittel und das Risikofenster zu "maßgeschneiderten" die Annäherung an den spezifischen experimentellen Frage von Interesse anzupassen.
Ein wichtiges Kriterium für die Bestimmung, dass die Schnittkulturen sind ein gültiges Modell für postnatale Neurogenese Forschung ist die Möglichkeit, in den Hippocampus zu färben und zu quantifizieren neugeborenen Neuronen. Die beiden wichtigsten Erkenntnisse zur Unterstützung dieser Hypothese war, dass die mikroskopische Analyse ergab immunhistochemische Reaktivität für CldU und endogene Protein-Marker in den gleichen Neuronen.In Verbindung mit endogenen neuronalen Marker verwendet, Thymidin-Analoga wie BrdU und CldU sind leistungsfähige Werkzeuge für die Neurogenese Forschung.
Die Anwendung von Thymidin-Analoga wie BrdU durch intraperitoneale Injektionen wird allgemein in der Neurogenese Forschung Etikett Neuronen läuft die S-Phase der Mitose 29 verwendet. Ähnliche Ansätze können in organotypischen Kulturen mit gewissen Modifikationen, verwendet werden. Zum Beispiel früheren Studien verabreicht BrdU (0,5 uM für 3 Tage) zu den Kulturen nach ~ 14 DIV 18 schneiden. Die Überprüfung der in diesem Papier präsentierten Daten zeigen, dass einige der Metriken zur Quantifizierung der Neurogenese nicht den Standardtechniken im Bereich der Neurogenese verwendet, dh stereo Quantifizierung 30 zu verwenden und verwendet. Zum Beispiel bei der Darstellung der Co-Expression von BrdU und Neuronal-Kerne (NeuN) positive Zellen, eine Gesamtzahl von Zellen "pro Kultur" zeigen sie anstelle der Bereitstellung informierenation hinsichtlich Gewebebereich oder Volumen.
Nachfolgende Studien auf diesem Verfahren verbessert durch die Unterteilung der kultivierten Scheiben, einzelne 10 um Abschnitte, die Visualisierung und Immunhistochemie Protokolle, indem Antikörper, um die Gewebeproben 31 leichter durchdringen verbessert. Bunk et al. 28 berichtet Doppelmarkierung mit BrdU (10 uM für 3 Tage) als die Zahl der Co-markierten Zellen pro 10 & mgr; m Abschnitt, aber nicht geben Auskunft über den Vergleichsbereich oder bestimmte Region des Hippocampus untersucht dh CA1, CA3 oder DG. Darüber hinaus Analyse der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie und Bilder nicht überzeugend zeigen, dass Hippocampus Morphologie wurde erfolgreich gepflegt.
Wichtig ist, verwendet beide Studien eine BrdU Exposition Zeitraum von 3 Tagen, die Nachteilen verbunden ist. BrdU-Markierung hat stark Neurogenese Studien gestützte indem Ermittler neu geteilten Zellen in va verfolgenschiedenen Hirnregionen. Jedoch BrdU Toxizität wurde ebenfalls gut charakterisiert. Seine Verwendung hat sich gezeigt, morphologischen und Verhaltensstörungen 32,33 und negative Auswirkungen auf den Zellzyklus, Differenzierung, Migration und Überleben von Nervenstammzellen 34-36 verursachen. Die verlängerte Verabreichung von BrdU in den zuvor genannten Studien können Störvariablen, die Hippocampus-Physiologie verändert und während einige Nebenwirkungen von BrdU-Administration kann unvermeidbar sein, war unser experimentelles Protokoll entwickelt, um einige dieser Komplikationen durch Inkubation des Gewebes mit Thymidin-Analoga zur Begrenzung eingeführt haben 2 Std. Außerdem wählten wir CldU statt BrdU verwenden, weil es zeigte eine bessere Löslichkeit als BrdU bei der Herstellung der Inkubationslösung. Obwohl die 3-Tages-Protokoll kann für bestimmte experimentelle Designs zB sein, die Maximierung der Kennzeichnung von proliferierenden Zellen, hat diese 2 h-Protokoll einen Vorteil Pulsmarkierung mit einer relativ kleinen Bevölkerungtion von Zellen, die in gewünschten Überlebenszeit untersucht werden können (siehe Abbildung 2B).
Durch den Vergleich der Höhe der neuronalen Produktion nach zwei verschiedenen Methoden der BrdU-Anwendung, Namba et al. Einen wichtigen Beitrag, um Markierungstechniken in organotypischen Kulturen 37. Die Autoren verglichen die intraperitoneale (IP) Injektion von BrdU (50 mg / kg) in postnatalen Tag 5 (P5) Ratten mit in vitro-Kulturen, die Kulturmedium, das 1 & mgr; M BrdU für 30 Minuten unmittelbar nach der Explantation des Gewebe übermittelt. Sie berichten, keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen in-vivo und in-vitro-BrdU frühe Einspritzung in gezüchteten Gewebes. Die Autoren nicht präsentieren klare Bilder umreißt die Hippocampus-Struktur, sondern sie BrdU-Immunreaktivität als Prozentsatz der gesamten Zellen in der Körnerzellschicht zu melden. Während sie stereo Zählen beschäftigen, ein Maß von Flächen- oder Volumen wäre wertvoll. Im AllgemeinenDie zitierten Studien vorhanden organotypischen Kulturen als eine sorgfältige Detaillierung der postnatalen Hippocampus Scheibe Kulturen, mit Anwendungen für das Studium der Neurogenese und pharmakologische Störungen. Mit dieser Technik kann Hippocampusscheiben für bis zu 21 Tagen in vitro (DIV) aufrechterhalten werden, und Medikamente können dem Medium an einem beliebigen Punkt in der Kulturperiode hinzugefügt, um die Wirkung auf die Neurogenese untersuchen.
Unser Ziel war es, eine diskrete, relativ homogene Bevölkerung DGCs durch die Bereitstellung einer kurzen 'Puls' Anwendung CldU 2 Stunden zu kennzeichnen. Eine üblicherweise verwendete Untersuchungsmethode für die Neurogenese beinhaltet Identifizierung der Reifephase eines Neurons über immunhistochemische Färbung für verschiedene endogene Marker mit einem Thymidinanalogon. Konfokale Fluoreszenzmikroskopie bestätigte die Anwesenheit von Kernen, die Thymidinanalogon CldU aufgenommen und wurden daher aktiv Mitose während des Kulturzeitraums, Fig. 2 In-vivo-Gewebeanalyse verwendet werden, können für die Schnittkulturen angepasst werden.
Genauer gesagt, ist ein häufig verwendetes Verfahren in der Neurogenese Forschung zur immunohistochemischen Färbung für die Mikrotubuli-assoziierten Protein, DCX, die überwiegend in unreifen Neuronen von Tag 3-21 und dem reifen neuronalen Marker, Calbindin (CaBP) ausgedrückt wird, die folgende vollständig ausgedrückt wird zuführen 28 Tage nach der Mitose. Der Phänotyp CldU + Zellen wurde unter Verwendung dieser endogenen Marker 26 bestimmt.
Verbesserte Verfahren zur Aufrechterhaltung der Schnittkulturen über einen längeren Zeitraum kann den zusätzlichen Vorteil, dass mehr CldU + Neuronen, um das reife, CaBP + Stadium zu erreichen. Derzeit ist eine Begrenzung der organotypischen Kultur Ansatz, dass das Gewebe kontinuierlich während des Kulturzeitraums verändert. Zum Beispiel, unmittelbar im Anschluss an Hippocampus-Dissektion und Beschichtung von Scheiben, die tiSSUE hat eine Breite von etwa 400 um. Jedoch nach 2-3 Wochen in der Inkubationskammer, Gewebeschnitte werden auf dünnen beginnen, was zu einer endgültigen Breite zwischen 250-350 & mgr; m ergibt. Dies begrenzt die Menge an Gewebe, das für die Immunhistochemie eingesetzt werden können und sollten bei der Planung, wie viele Tiere für ein Projekt verwendet werden. Zusätzliche Experimente hilft prägen die funktionelle Veränderungen im Hippocampus Physiologie, die in vitro auf.
Das Protokoll zum Schneiden und Färben von Schnitten des Hippocampus wurde entwickelt, um zelluläre und morphologische Veränderungen während der Anzucht statt analysieren. Schnittkulturen bieten die Möglichkeit, die Wirkung von verschiedenen pharmakologischen Wirkstoffen testen wie Hippocampus DGCs durch verschiedene Entwicklungsstadien passieren während der Reifung und stellen ein wertvolles Werkzeug für zukünftige Studien der adulten Neurogenese.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
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