Summary
يصف هذا البروتوكول الثقافة الابتدائية / ثقافة مشتركة من الماوس أنسجة المبيض، وذلك باستخدام المبايض من الفئران حديثي الولادة وحويصلات المبيض الفردية من الفئران سابق للبلوغ. تقنيات ثقافة تدعم التنمية بطريقة الفسيولوجية للغاية، مما يسمح للتحقيق في تأثير العوامل الخارجية على المبيض، والتفاعلات بين الحويصلات المبيضية.
Abstract
ويتكون المبيض الثدييات من الحويصلات المبيضية، كل المسام التي تتكون من بويضة واحدة تحيط بها الخلايا المحببة الجسدية، والمغلقة معا داخل الغشاء القاعدي. وضعت بركة محدود من بصيلات أسفل أثناء التطور الجنيني، عندما البويضات في اعتقال الانتصافي تشكل ارتباط وثيق مع الخلايا المحببة بالارض، وتشكيل بصيلات البدائية. قبل أو بعد الولادة مباشرة، المبايض الثدييات تحتوي على إمدادات حياتهم من بصيلات البدائية، من هذه النقطة فصاعدا هناك إصدار ثابت من بصيلات في بركة الجريبي المتنامية.
المبيض هو الانقياد وخاصة في التنمية في المختبر، مع بصيلات تنمو بطريقة الفسيولوجية للغاية في الثقافة. يصف هذا العمل ثقافة المبايض حديثي الولادة كلها تحتوي على بصيلات البدائية، وثقافة حويصلات المبيض الفردية، والطريقة التي يمكن أن تدعم تطوير المسام من غير ناضجة من خلال لpreovuمرحلة latory، وبعد ذلك البويضات التي هي قادرة على الخضوع الإخصاب في المختبر. العمل المذكورة هنا يستخدم نظم الاستزراع لتحديد كيفية تأثر المبيض عن التعرض لمركبات الخارجية. أيضا نحن تصف نظام المشاركة في الثقافة، والذي يسمح التحقيق في التفاعلات التي تحدث بين تزايد بصيلات والتجمع غير نموا من بصيلات البدائية.
Introduction
ويتكون المبيض الثدييات العرض العمر الأنثى من البويضات، كل الواردة ضمن جراب المبيض. يتم تشكيل بصيلات قبل الولادة في يستريح، مرحلة البدائية: بعد أن يتم تأسيس تجمع المسام، هناك حركة مستمرة وتدريجية من بصيلات من بدائية في بركة جريب المتنامية. كما بصيلات تبدأ في النمو، ويطورون من خلال المراحل الابتدائية والثانوية، preantral ثم الغارية، حتى يصلوا إلى سابق للإباضة، أو غراف، المرحلة. فقط البويضات من الحويصلات سابق للإباضة لهم الولاية التنموي الكامل، وقادرة على دعم التطور الجنيني إلى المدى، إذا المخصبة.
المعروف منذ وقت طويل المبيض لتطوير بطريقة الفسيولوجية للغاية في المختبر. هذا ومن المرجح أن يكون راجعا إلى كل جريب المبيض تحتوي في داخلها الخلايا اللازمة لدعم بويضة من مرحلة غير ناضجة (وعند هذه النقطة يصبح غير قادر على إكمال الميتوزي به) من خلال لرانه مرحلة المختصة تنمويا (وعند هذه النقطة يمكن أن تدعم بشكل كامل الانتهاء من الانقسام المنصف والتسميد وتطور الجنين مما يؤدي إلى المدى).
وقد أدى الطبيعة الفسيولوجية للتنمية المبيض في المختبر إلى الاستخدام الواسع للتقنيات زراعة المبيض. ونتيجة لذلك، وقد استخدمت في المختبر وسائل للتحقيق في التنظيم للتنمية المبيض، أمراض المبيض (على سبيل المثال أن من متلازمة تكيس المبيض، متلازمة تكيس المبايض)، والفحص عن كيفية المبايض / البويضات تتأثر التعرض للمواد الكيميائية، وأيضا بهدف العملي ل الحصول على البويضات fertilizable من الحويصلات المبيضية البدائية. حتى الآن، وقد تحقق هذا الأخير فقط باستخدام الماوس المبيض الأنسجة 1، على الرغم من أن تقنيات زراعة باستخدام بصيلات من الثدييات الكبيرة، بما في ذلك البشر، قد تحسنت بشكل كبير في السنوات الأخيرة 2،3.
وصفنا هنا عدة طرق الثقافة باستخدام الماوس أنسجة المبيض. وmetho الأوليستخدم د كلها المبايض الماوس حديثي الولادة، ويدعم تشكيل والتنمية في وقت مبكر من بصيلات البدائية 4. يدعم النظام الثاني نمو الفردية، جراب المبيض سليمة من preantral في وقت متأخر إلى مرحلة سابق للإباضة. باستخدام هذه التقنية، المسام يمكن تربيتها بشكل فردي، أو في أزواج 5،6. وأخيرا، نحن تصف نظام المشاركة في الثقافة، والجمع بين تقنيات الأولين في طريقة تسمح التحقيق في التفاعلات بين النمو والحويصلات المبيضية البدائية 7.
ثقافة الفردية حويصلات المبيض سليمة تتيح نمو بصيلات يتم تحديدها من القياسات بصيلات اليومية خلال الفترة الثقافة، في حين أن التحليل المتوسط يسمح التحقيق في بصيلات / إنتاج هرمون المبيض. ويمكن تحقيق المزيد من التحليلات الأنسجة من قبل مجموعة من بصيلات أو أنسجة المبيض في نهاية الثقافة، لتحليل النسيجي / immunohistological أو للتجهيز لاحق على سبيل المثال للحصول علىمرنا أو البروتينات.
Protocol
تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بموجب ترخيص من قبل وزارة الداخلية في المملكة المتحدة (رقم الترخيص مشروع PPL 60/1726 و60/4026).
ملاحظة: الحيوانات البيت وفقا للمتطلبات القانونية في المملكة المتحدة في ضوء 14 ساعة و 10 ساعة الإضاءة المظلمة. التجارب على الحيوانات السلوك باستخدام النوع البري الفئران C57Bl6J والفئران تاو-GFP التي لها التعبير في كل مكان من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) 8، وThy1-YFP الفئران مع التعبير عرضية من الأصفر البروتين الفلوري (YFP) في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية 9: سواء كانت ولدت خطوط المعدلة وراثيا على خلفية C57Bl6J.
1. ظروف العمل وإعداد الأدوات
- أداء جميع إعداد وسائل الإعلام، تشريح الأنسجة، والعمل الثقافة في غطاء تدفق الصفحي لضمان العقم: هذا يتجنب شرط إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام.
- تسمح دائما وسائل الاعلام / لوحات ثقافة / أطباق الجنين للتوازنلا يقل عن 1 ساعة، في C الفرن 37 درجة (تشريح المتوسطة / أطباق الجنين) أو 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة (مستنبت وألواح)، قبل استخدامها.
- نقع الماصات الزجاجية في حل 0.1٪ من ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة ساعة تقريبا، ثم تترك لتجف. سحب الماصات في شعلة الموقد بنسن، والانحناء الزجاج كما كنت تفعل ذلك، لإنتاج مرسوم بدقة الماصات الزجاجية المنحنية. بعد يتم سحبها ماصة، وجعل قطع نظيفة مع قطع الزجاج. تعقيم الفرن على 160 درجة مئوية لمدة حوالي 45 دقيقة.
ملاحظة: مخزن لهذه الماصات الزجاجية وستكون هناك حاجة لنقل المبيض وبصيلات.
2. إعداد تشريح والثقافة وسائل الإعلام
- إعداد تشريح المتوسطة.
- حل 3 ملغ / مل BSA في ليبوفيتش L15 المتوسطة وتصفية تعقيم خلال 0.2 ميكرون المسام، 25 مم مرشح قطر.
- حديثي الولادة المبيض الثقافة.
- لإعداد المتوسطة للثقافة المبيض حديثي الولادة، وجعل 1 مل من المتوسط لمجموعة شرق افريقياح المبيض التي سيتم زرعها. حل 3 ملغ / مل BSA في α الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (αMEM) وتصفية تعقيم خلال 0.2 ميكرون المسام، 13 مم مرشح قطر في أنبوب العقيمة.
- لإعداد لوحات للثقافة المبيض حديثي الولادة، إضافة 1 مل من الأطفال حديثي الولادة مستنبت المبيض في كل بئر (مبيض واحد لكل بئر) من 24 لوحة جيدا. باستخدام ملقط معقم ساعاتي، وضع غشاء البولي واحد على أعلى من المتوسط في كل سطح بشكل جيد، لامعة. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الأغشية قبل الاستخدام.
- جريب الثقافة.
- لإعداد المتوسطة للثقافة جريب، ملحق α-الحد الأدنى وسائل الإعلام الأساسية مع 1 وحدة دولية / مل المؤتلف جريب تحفيز هرمون البشري، 5 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك و 5٪ ت / ت مصل الحصول عليها من إناث الفئران البالغات. فلتر تعقيم خلال 0.2 ميكرون المسام، 13 مم مرشح قطر في أنبوب العقيمة.
- فلتر تعقيم زيت السيليكون من خلال 0.45 ميكرون المسام، 25 مم مرشح قطر، في أنبوب العقيمة.
- لإعداد جيش التحرير الشعبى الصينىقسم التدريب والامتحانات، ضع قطرات 30 ميكرولتر من بصيلات مستنبت في كل بئر من ثقافة غير الأنسجة المعالجة 96-جيدا عيار مكروي لوحة الجولة جيدا، فقط باستخدام الصف العلوي من كل لوحة (للسماح بصيلات إلى أن انتقلت الى صفوف جديدة خلال كل يوم الفترة الثقافة). تراكب بعناية المتوسطة مع 70 ميكرولتر من زيت السيليكون تعقيمها، لمنع التبخر المتوسط.
- -جراب المبيض المشارك الثقافة.
- إعداد المتوسطة ل-جراب المبيض شارك في الثقافة كما للثقافة جريب في الخطوة 2.3.1 أعلاه، ما يجعل منها 1 مل من المتوسط ليتم تعيين كل-جراب المبيض شارك في ثقافة ما يصل.
- لإعداد لوحات، إضافة 1 مل من المتوسط في كل بئر من 24 لوحة جيدا. باستخدام ملقط معقم ساعاتي، ومكان واحد غشاء Nucleopore على أعلى من المتوسط في كل سطح بشكل جيد، لامعة. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الأغشية قبل الاستخدام.
3. حديثي الولادة المبيض تشريح والثقافة
- ضع 1 مل من تشريح المتوسطة في كل صحن من الزجاج الجنين العقيمة. <لى> إعدام الجراء الماوس حديثي الولادة تتراوح أعمارهن بين يوم بعد الولادة 0 و 5، اعدام بقطع الرأس وفقا للوائح وزارة الداخلية في المملكة المتحدة.
- فهم الجلد التي تغطي جدار البطن باستخدام زوج من ملقط تشريح الدقيقة وإجراء شق كبير في الجلد والجسم الجدار. سحب فتح شق ذلك يتعرض البطن بأكمله. وعادة ما يتم محتقن المثانة في هذه المرحلة ويمكن ثقب لجعل تشريح أسهل.
- نقل الشجاعة للخروج من الطريق باستخدام ملقط ساعاتي. اتبع قرون الرحم من المثانة إلى الكلى على كل جانب. يقع المبيض أقل بقليل من الكلى في الجزء العلوي من الرحم وسوف تظهر كهيكل تشبه سحابة تحت المجهر تشريح.
- فهم المبيض بلطف مع ملقط ساعاتي، واستخدام مقص لقطع تمسكه الرحم. نقل زوج من المبايض في أطباق تحتوي على الجنين قبل تحسنت المتوسطة تشريح.
- تنفيذ تشريح غرامة من المبيض تحت المجهر تشريح على ستا ساخنةجنرال الكتريك (37 ° C). استخدام إبر الأنسولين لخفض بعيدا الكيس جرابي وأي المواد الزائدة بما في ذلك قناة فالوب، حتى يبقى فقط المبيض.
- نقل كل المبيض في البئر لوحة الثقافة التي أعدت في الخطوة 2.2.2 أعلاه، باستخدام ماصة الزجاج المنحني مرسوم بدقة، مبيض واحد على رأس كل منهما غشاء (انظر الشكل 1A). الثقافة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة.
- تغيير المتوسطة كل يوم الثاني. استخدام ماصة لتبادل 50٪ من المتوسط في كل بئر لبالغاز قبل الطازجة المتوسطة: مكان غيض ماصة على حافة البئر من المتوسط لتجنب إزعاج الغشاء.
- الحفاظ على الثقافات لمدة تصل إلى 6 أيام.
- في نهاية الثقافة، وتجميد المتوسطة وإصلاح أو تجميد المبايض بعد غسل وجيزة في برنامج تلفزيوني، على النحو المطلوب.
- إصلاح المبايض في تثبيتي بوان لمدة 90 دقيقة للتحليل النسيجي، أو في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لمدة 90 دقيقة لتحليل immunohistological. التقط تجميد المبايض عن طريق وضع الأنسجة فيأنبوب البولي بروبلين، ووضع أنبوب في الثلج الجاف لمدة 5-10 دقائق قبل التجميد في -70 درجة مئوية لمدة لاحقة البروتين أو استخراج مرنا.
4. المسام تشريح والثقافة
- اعدام إناث الفئران القديمة 19-23 يوم وعزل المبايض. الرطب الفراء مع الايثانول 70٪ قبل اتخاذ أي شقوق. قرصة الجلد باستخدام ملقط مفتوحة حادة وإحداث شق كبير في البطن مع مقص تشريح، اختراق من خلال كل من الجلد وجدار الجسم.
- تحريك الأمعاء للخروج من الطريق باستخدام مجموعة من الأدوات الدقيقة تشريح وتحديد الرحم. اتبع الرحم حتى المبيض الذي يقع تحت الكلى على كل جانب.
- استيعاب بلطف المبيض باستخدام زوج من ملقط ساعاتي، قطع المرفق المبيض إلى الرحم مع مقص تشريح غرامة. تجنب جمع الكثير من لوحة الدهون المبيض. جمع المبايض ونقل إلى الأطباق التي تحتوي على الجنين قبل تحسنت المتوسطة تشريح.
- إعادةنقل الجراب المبيض باستخدام إبر الأنسولين لخفض بعيدا الكيس جرابي وأي المواد الزائدة بما في ذلك قناة فالوب، حتى يبقى فقط المبيض. النصف تقريبا كل المبيض باستخدام الإبر الأنسولين.
- نقل بعناية كل نصف المبيض، إلى الزجاج ووتش الفردية التي تحتوي على 1 مل تشريح المتوسطة. تغطية كل الزجاج ووتش مع شريحة زجاجية لمنع تبخر المتوسطة وضمان العقم.
- نظارات متجر الساعات التي تحتوي على نصفين المبيض في فرن C 37 درجة لحين الحاجة إليها، ولكن تنفيذ الخطوة تشريح المقبلة في أقرب وقت ممكن. تجاهل الأنسجة المخزنة في هذا الطريق لأكثر من ساعة.
- نقل المشاهدة زجاج تحتوي على نصف المبيض إلى 37 درجة مئوية المسرح المجهر ساخنة في غطاء تدفق الصفحي. تقريبا تشريح المبيض إلى قطع كبيرة باستخدام اثنين من الإبر الأنسولين، من أجل تحديد بصيلات قبل الغارية أواخر النحو التالي: هذه سوف تحتوي على 2-3 طبقات من الخلايا المحببة ويكون قطرها حوالي 180-200 ميكرون.
- تشريح يدويا أي طبصيلات dentified باستخدام أحد إبرة الأنسولين واحدة 30 × 0.25 ملم الوخز بالإبر إبرة التي تم تأمينها في حامل الإبرة. كن حذرا لإزالة معظم سدى المحيطة بها، ولكن تجنب الإضرار الصفيحة القاعدية من المسام (انظر الشكل 1B).
- استخدام مرسومة بدقة ماصة الزجاج المنحني لنقل بعناية بصيلات تشريح في كوب جمع الساعات التي تحتوي مسبقا تحسنت المتوسطة تشريح. توخي الحذر للحفاظ بصيلات داخل القسم العيار رقيقة من ماصة لتجنب فقدان المسام.
- بصيلات قياس بدقة باستخدام لgraticule العدسة معايرة تركيبها في المجهر تشريح.
- اختر بصيلات للثقافة إلا إذا كانت قياس 190 ± 10 ميكرون في القطر. وعلاوة على ذلك تحديد صحية، وبصيلات كروية الوحيدة للثقافة. وهذه سوف تكون شفافة، من دون المناطق رتقي مظلمة، ويكون لها الصفيحة القاعدية سليمة، جنبا إلى جنب مع بعض الأنسجة قرابي المرفقة: تجاهل أي بصيلات التي لا تناسب هذا الوصف. والعائد من بين 10-15 بصيلات في المبيض جيدة.
- استخدام مرسومة بدقة ماصة الزجاج المنحني لنقل بصيلات واحد في البئر لوحة تتكون كما في الخطوة 2.3.3 أعلاه. وضع بعناية المسام في قاع البئر (وليس في طبقة النفط العليا). الثقافة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة.
- بصيلات الثقافة لمدة تصل إلى 6 أيام، تتحرك بصيلات إلى وسيلة جديدة تحتوي جيدا كل يوم.
- تحضير الصف التالي في لوحة 96-كذلك في إعداد لوحة في الخطوة 2.3.3 أعلاه. العودة لوحة إلى الحاضنة لمدة ساعة على الأقل، للسماح للموازنة. نقل بصيلات في آبار جديدة من المتوسط، وذلك باستخدام ماصة الزجاج مرسوم بدقة.
- إذا في أي لحظة في الثقافة بصيلات هي أن تترك لمدة يومين قبل أن ينتقل إلى متوسطة جديدة، وضع كل بصيلات في ما لا يقل عن 60 ميكرولتر (بدلا من 30 ميكرولتر) قطرات من الثقافة بصيلات المتوسطة.
- لجمع البيانات عن نمو بصيلات، وقياس بصيلات يوميا، وذلك باستخدام إرنست و يونغepiece graticule تركيبها في المجهر تشريح. سوف طبقة النفط يشوه قياسات قطر المسام، لذا عمل على معامل المعايرة لمجموعة المتابعة.
- في نهاية الثقافة، وتجميد المتوسطة وإصلاح أو تجميد الأنسجة لتحليلها لاحقا، كما في الخطوة 3.10 أعلاه.
- جراب-جراب المشارك الثقافة.
- ثقافة اثنين من بصيلات معا، لتحقيق التفاعل بين بصيلات. الثقافة على النحو الوارد أعلاه، ولكن وضع اثنين من بصيلات جنبا إلى جنب، في الاتصال، في بئر.
- وضع قطرات 100 ميكرولتر من بصيلات مستنبت في كل بئر من ثقافة غير الأنسجة المعالجة 96-جيدا عيار مكروي لوحة مسطحة بشكل جيد، وتتراكب المتوسطة مع 100 ميكرولتر من زيت السيليكون معقمة. لا نقل بصيلات في آبار جديدة كما في الخطوة 4.13 أعلاه، ولكن بدلا من استخدام هلام غيض غرامة لتغيير 50٪ من المتوسط كل يوم.
- من أجل تحديد أصول الأنسجة داخل الثقافة المشتركة، وشارك في ثقافة بصيلات كل من مصدر وراثية مختلفة، على سبيل المثال سشمال شرق من المبيض من نوع الماوس البرية، والآخر من المبيض على فأرة الحاسوب مع التعبير في كل مكان من GFP. في حالة استخدام GFP أو الأنسجة YFP، تقليل تعرض الأنسجة للضوء قدر الإمكان، خلال الثقافة، وذلك من خلال خطوات تثبيت / التجهيز بعد ذلك.
ملاحظة: فمن الطبيعي لبصيلات اثنين لتنمو معا في، وحدة "اثنين من جراب 'واحدة (انظر الشكل 1C).
5. جريب المبيض المشارك الثقافات
- تشريح المبيض وبصيلات خارج كما هو الحال في القسمين 3 و 4 أعلاه.
- وضع المبيض حديثي الولادة واحد على رأس الغشاء، في لوحة أعدت كما في الخطوة 2.4.2 أعلاه. وضع بعناية جريب واحد في اتصال مع قطب واحد من المبيض حديثي الولادة، وذلك باستخدام ماصة الزجاج المنحني مرسومة بدقة. الثقافة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة تصل إلى 5 أيام.
- من أجل التمييز بين أصل الأنسجة داخل الثقافة المشتركة، واستخدام المبيض وبصيلات من اثنين مختلفة جداurces، على سبيل المثال واحدة من نوع الماوس البرية، واحدة من الماوس مع التعبير في كل مكان من GFP.
- استبدال 500 ميكرولتر من المتوسط يوميا كما في الخطوة 3.8 أعلاه، ولكن باستخدام ثقافة بصيلات المتوسطة. خلال ثقافة مشتركة، جراب في كثير من الأحيان يصبح تغليف بواسطة المبيض (1D الشكل).
- في نهاية الثقافة، وتجميد المتوسطة وإصلاح أو تجميد الأنسجة لتحليلها لاحقا، كما في الخطوة 3.10 أعلاه.
6. التثبيت، كيمياء سيتولوجية مناعية والتصوير من الأنسجة مثقف
- في نهاية الثقافة، وغسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني ونقل إلى 100 ميكرولتر (جراب) أو 1 مل (المبيض) من 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة، وإصلاح لمدة 1 ساعة على الجليد. التحرك من خلال 3 يغسل من برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية.
- لمناعية على بصيلات، ونقل بين الآبار من 96 بئر عيار مكروي لوحة الجولة جيدا باستخدام ماصة الزجاج المنحني مرسوم بدقة، مع كل منها يحتوي على بئر يغسل أو العلاجات المختلفة.
- لمناعية على ovariوفاق (أو المبيض، جريب المشترك الثقافات)، تضمين في 4٪ هلام الاغاروز والقسم في 50 ميكرون باستخدام vibrotome. أقسام تطفو في الآبار من 24 لوحة جيدا لتطبيق يغسل أو العلاج، وإزالة مع ماصة.
- للتصوير: نقل أقسام الاغاروز إلى الشرائح الزجاجية المسطحة وجبل مع تصاعد المتوسطة. أو بصيلات نقل (أو المجمعات جراب-جراب) على الشرائح الزجاجية تجويف وجبل مع غير تصلب تركيب المتوسطة. صورة العينات باستخدام مجهر متحد البؤر.
Representative Results
ويبين الشكل 1 صور من المبيض وبصيلات في بداية وأثناء، والإجراءات الثقافة.
ويبين الشكل 2 نتائج ممثلة من المبايض حديثي الولادة (هنا والمبيض من الجراء حديثي الولادة) تتعرض لالسامة الإنجابية خلال الثقافة. كان المثقف المبايض حديثي الولادة لمدة 6 أيام، ويتعرض لدواء العلاج الكيميائي، إما سيسبلاتين أو دوكسوروبيسين، في يوم 2 من الثقافة. في نهاية الثقافة، تم إصلاحها المبايض، ومعالجتها للالأنسجة، ومن ثم فحص المبايض لتحديد عدد الحويصلات المبيضية صحية وغير صحية 4. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على تقييم أكثر سرعة من بصيلات متزايد في وقت مبكر من ثقافة شظايا المبيض، وذلك باستخدام المبايض من ماوس إبداء علامة بويضة محددة الفلورسنت 10.
خلال ثقافة بصيلات الفردية، ونمو بصيلات يمكن التأكد بسهولة عن طريق القياسات اليومية خلال طريق مسدودفترة تلح. الشكل 3 يبين نتائج ممثلة لنمو بصيلات مثقف في وجود أو عدم وجود هرمونات موجهة للغدد التناسلية للجريب تحفيز هرمون (FSH) والهرمون (LH) 5.
جراب-جراب أو جريب المبيض شارك في الثقافة يمكن استخدامها لتحقيق التفاعل بين بصيلات. اعتمادا على النسيج والتجهيز والصور يمكن الحصول عليها باستخدام مشرق الميدان، مضان أو المجاهر مبائر. ويبين الشكل 4 نتائج ممثلة من الصور من هذا القبيل المشترك الثقافات، ودراسة مختلف أنواع الخلايا المشاركة في الاتصالات جراب-المسام، بما في ذلك البطانية والخلايا العصبية 7.
الشكل (1): (A) صورة مجهرية من المبيض حديثي الولادة تم الحصول عليها من الماوس على يوم الولادة، وضعت على غشاء البولي. (ب) صورة مجهرية من الطازج تشريح بصيلات المبيض صحي، مع معظم الأنسجة اللحمية المحيطة تشريح بعيدا. (C) Photomicrographs من شارك في ثقافة اثنين من الحويصلات المبيضية خلال الأيام الثلاثة الأولى من الثقافة، والتي تبين اتصال وثيق التي تطور بين بصيلات اثنين كما عائدات الثقافة (تسى: اليوم الأول من الثقافة، CII: اليوم الثاني من الثقافة، CIII : اليوم الثالث للثقافة). مستنسخة من سبيرز وآخرون. 11 (D) صورة مجهرية من المشارك مثقف بصيلات preantral والمبيض حديثي الولادة بعد يومين من الثقافة. وتظهر صورة المسام تصبح مغلفة من قبل المبيض. يظهر السهم بصيلات preantral. صورة من الدكتور فيديريكا لوبيز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
جوري 2 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52458 / 52458fig2.jpg "/>
الشكل 2: تأثير للأدوية العلاج الكيميائي سيسبلاتين ودوكسوروبيسين على المبايض مثقف حديثي الولادة سيسبلاتين ودوكسوروبيسين كلا تؤدي إلى فقدان الصحة المسام وتقليل أعداد المسام. (A) سيسبلاتين. (B) دوكسوروبيسين: (ط) النسبة المئوية من بصيلات غير صحية (واضح)؛ و (ثانيا) إجمالي عدد بصيلات (مظللة) في كل المبيض. الحانات دلالة يعني + ووزارة شؤون المرأة. ن = 5 لجميع الفئات، والنجوم للدلالة فروق ذات دلالة بالنسبة إلى السيطرة (* P <0.05، ** p <0.01، *** P <0.001). مستنسخة من مورغان وآخرون. 4
الشكل 3: النمو معدلات بصيلات تتعرض لبيئات مختلفة الاقناد المصلية القيم يعني ± SEM (ن ≥16 لكل مجموعة). السهم يشير إلى بداية غيرانتشكيل لتر في جميع الفئات موجهة للغدد التناسلية. مستنسخة من موراي وآخرون. 5
الشكل 4: صور من المسام، المسام والمبيض، جريب المشترك الثقافات، والتي تبين التفاعلات جريب-جريب (A) صورة مجهرية متحد البؤر من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) المسام والبرية من نوع (WT) بصيلات بعد شارك في ثقافة (. GFP التعبير هو موضح هنا في أبيض)، مع العمليات من بصيلات GFP أظهرت يمتد على بصيلات WT. (B) عبر قسم من خلال / WT مجمع جراب GFP التالية شارك في الثقافة، وتبين أن عمليات GFP (الأخضر) من المجاورة للجريب كذبة المتاخمة للالصفيحة القاعدية من المسام WT. (C) حديثي الولادة WT المبيض التالية الثقافة مع ما قبل غاري فقد هاجر المسام، والتي تبين أن الخلايا GFP والعمليات الخلوية (الأخضر)، معربا عن GFPمن خلال interstitum المبيض المبيض حديثي الولادة. (D) GFP / WT مجمع جراب التي تحتوي على الخلايا البطانية، كما هو موضح من قبل التعبير عن البطانية CD31 علامة الخلية (الحمراء). (E) GFP / WT مجمع جراب التي تحتوي على الخلايا العصبية، كما هو موضح من قبل التعبير عن علامة العصبية تويولين بيتا III (انظر هنا بالحمرة، أو الأصفر إذا المزدوج المسمى مع GFP، والأخضر). مجمع جراب (F) YFP / WT، حيث يشير YFP إلى بصيلات من ماوس Thy1-YFP التي لديها التعبير عرضية من البروتين الفلوري أصفر (YFP: الأصفر) في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية 9، وتبين أن الخلايا العصبية تمتد من بصيلات YFP. الحانات 50 ميكرون (A، B، D)، و 100 ميكرون (C، E، F)، و 100 ميكرون (أقحم في A)، 10 ميكرون (أقحم في C)، و 15 ميكرون (أقحم في D). مستنسخة من كامبل وآخرون. 7 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذه فايجوري.
Discussion
نحن هنا وصف نظم الاستزراع المختلفة التي يمكن استخدامها لدعم تطوير الماوس حويصلات المبيض في المختبر، وذلك باستخدام المبايض حديثي الولادة كلها تحتوي فقط على المراحل الأولى المسام، الفردية حويصلات المبيض preantral وأيضا الثقافات مشاركين للأنسجة اثنين.
ثقافة الأطفال حديثي الولادة المبايض الماوس تدعم تطوير المبيض في وقت مبكر، بدء نمو بصيلات ولا سيما ما يصل إلى المرحلة الثانوية جراب. وهناك مجموعة من أعمار الفئران حديثي الولادة يمكن استخدامها لهذه الثقافات، وهذا يتوقف على مراحل تطور المصالح. إذا ويتم الحصول على المبايض من الفئران حديثي الولادة، سيكون تشكيل بصيلات جارية ولكن لم يكتمل بعد: سوف ثقافة تدعم جزئيا على الأقل تشكيل بصيلات استمرار يليه نمو بصيلات. بدلا من ذلك، استخدام المبايض من الفئران حوالي أربعة إلى خمسة أيام من العمر (التي تشكل المسام هو الوقت كاملة بالفعل) النتائج في ثقافة عدد أكبر من FOLLI البدائية ومتناميةجسيمات 12. وتشمل الجوانب المفيدة للتقنية محددة الموصوفة هنا استخدام العائمة الأغشية البولي، والتي تسمح بمزيد من الأوكسجين في الأنسجة، والثقافة في وسيلة أساسية جدا تتألف فقط αMEM وBSA، وتجنب استخدام المواد المضافة غير محددة مثل المصل. لا يبدو ثقافة المبايض كله لدعم التنمية ما بعد مرحلة جريب الثانوية، مع تطور لاحق تتطلب تغييرا في الأسلوب، مثل تشريح المجمعات خلية جريب-المحببة من المبيض حديثي الولادة مثقف 1.
ويمكن تطوير مراحل لاحقة من تطوير المسام في المختبر عن طريق تشريح خارج الفرد، سليمة بصيلات قبل الغارية في وقت متأخر، والتي يمكن زراعتها إلى مرحلة سابق للإباضة في الثقافة مع الحفاظ على هيكلها ثلاثي الأبعاد. استخدام بصيلات سليمة لهذه التقنية الثقافة يحافظ على العلاقة بين مكونات مسامي مختلفة كما يحدث في الجسم الحي. ثيالصورة نظام الثقافة يمكن استخدامها للحصول على البويضات التي يمكن أن تدعم الإخصاب وتطور الجنين اللاحقة.
كما يمكن الحصول على البويضات Fertilizable من الماوس المبايض حديثي الولادة باستخدام بروتوكول ثقافة الأولي الكثير كما هو موضح هنا، تليها مرحلة ثانية يتم خلالها نمت المجمعات خلية بويضة-المحببة في المختبر 1. وتشمل الأنظمة الأخرى المستخدمة في كثير من الأحيان إلى حد ما اليوم ثقافة بصيلات أو أنسجة المبيض الذي تم مغلفة في مواد مثل هيدروجيل الجينات، لتقديم الدعم (انظر، على سبيل المثال، Tagler وآخرون 13). الكثير من التركيز على التنمية الطريقة الآن هو تحسين تقنيات الثقافة لالمبيض وبصيلات من الثدييات الكبيرة، مع الهدف الطويل الأجل للحصول على البويضات fertilisable من بصيلات البدائية من مجموعة من الأنواع، بما في ذلك البشر.
في وقت واحد، المبايض الثدييات تحتوي على بصيلات في مجموعة من المراحل التنموية، مع interactioنانوثانية بين بصيلات تؤثر على تنظيمها. ويفهم من هذا الجانب وظيفة المبيض سيئة وصعبة لفحص في الجسم الحي. طريقة النهائي الموصوفة هنا يستخدم أنظمة الثقافة تشارك في دعم تطوير مراحل مختلفة من بصيلات في المختبر. إذا لزم الأمر، واحد أو كلا الأنسجة يمكن قبل المعاملة في الجسم الحي أو في المختبر للمشاركة في الثقافة السابقة. أنظمة شارك في ثقافة مثل هذه توفر وسيلة مثالية التي لدراسة التفاعلات جريب-المسام، على سبيل المثال كيف المتنامية، الجريبات الغارية تؤثر على بركة بصيلات البدائية، والجوانب البيولوجيا المبيض التي أثبتت صعوبة في دراسة حتى الآن.
تقنيات زراعة المبيض كلها هي واضحة إلى حد ما، على الرغم من تشريح دقيق هو مطلوب لتجنب تلف الأنسجة عرضيا. تشريح من بصيلات الفردية هي تقنية متخصصة، والتي تتطلب الممارسة المتكررة قبل أن يتم تشريح بصيلات في المرحلة المناسبة للخروج من المبيض سليمة ودون ضرر. ومن الأهمية بمكانلتشريح من بصيلات الفردية بعناية، أو أضرار لحقت به خلال بروتوكول تشريح يمكن أن يسفر عن وفاة بصيلات خلال الفترة الثقافة اللاحقة. حيث يتم وضع بصيلات مباشرة في البئر لوحات عيار مكروي، فمن المهم استخدام البلاستيك ثقافة غير الأنسجة المعالجة الوحيدة، للحد من الطلاء أسفل الخلايا قرابي على البلاستيك: إذا تم استخدام زراعة الأنسجة بلستيكور المعالجة، سوف بصيلات نعلق على قاعدة من البئر وتمزق عندما يكبرون. للجميع العمل المشترك والثقافة، ويجب أن توضع الأنسجة مباشرة على اتصال مع بعضها البعض.
المتوسط المفصلة أعلاه لاستخدامها في تقنية زراعة بصيلات يتضمن إضافة مصل الفأر. فمن الممكن أن تحل محل مصل الفأر مع المصل البقري الجنين، ولكن فقط دفعات من حين لآخر من هذا القبيل الأمصال الدعم الكامل تطوير المسام إلى مرحلة سابق للإباضة، مع دفعة الاختبار المطلوب لتحديد المصادر المناسبة. دفعة اختبار FSH هو المستحسن أيضا، حيث أن يوني الدوليةTS التي يتم من خلالها تقييم FSH القرين بصورة فجة فقط لنمو بصيلات في المختبر. إذا جراب تمزق يحدث بشكل روتيني خلال الفترة الثقافة، والتفكير في استبدال حمض الاسكوربيك الأسهم مع دفعة جديدة.
تقنيات لا تتطلب معدات متخصصة لا سيما أخرى من تشريح المجاهر وحاضنات زراعة الأنسجة، على الرغم من استخدام غطاء تدفق الصفحي وتقنية معقمة جيدة تسمح للحويصلات المبيض إلى أن تربيتها في غياب المضادات الحيوية، كما هو الحال في الطرق الموضحة هنا. هذا يمكن أن يكون مفيدا، لتجنب أي تأثير ضار محتمل من المضادات الحيوية على البويضات، لا سيما إذا أريد لها أن تكون المخصبة التالية الثقافة. حيث أنه من غير الممكن للعمل في بيئة معقمة، فإنه من المستحسن أن إضافة المضادات الحيوية لتشريح والثقافة وسائل الإعلام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | - | - | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium. |
| Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium |
| Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| 96-well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96-well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33 mm (29 G) + 1 ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilize, then warm before use. |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use. |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30 mm x 0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
- Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).
- McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles. Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).
- Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin. PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).
- Murray, A. A., et al. Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids. Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles. Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).
- Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein. Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Maiani, E., et al. Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib. Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).
- Spears, N., Bruin, dr, Gosden, J. P., G, R. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).
- Tagler, D., et al. Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).
