Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kultur og Co-Culture of Mouse Eggstokkene og ovariefollikler

Published: March 17, 2015 doi: 10.3791/52458
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Centre for Integrative Physiology, University of Edinburgh, 2MRC Centre for Reproductive Health, University of Edinburgh

Summary

Denne protokollen beskriver den primære kultur / co-kultur av mus eggstokkvev, ved hjelp av eggstokkene fra neonatale mus og individuelle ovariefollikler fra prepubertale mus. De kulturteknikker støtter utvikling i et sterkt fysiologisk måte, slik at undersøkelse av virkningen av ytre midler på eggstokken, og for interaksjoner mellom eggstokkfollikler.

Abstract

Pattedyr eggstokk er sammensatt av eggstokkfollikler, hver follikkel som består av en enkelt oocyte omgitt av somatiske granulosa celler, lukket sammen i en basalmembran. En begrenset pool av follikler er nedfelt under embryonal utvikling, når ubefruktede egg i meiotisk arrest danne et nært samarbeid med flate granulosa celler, forming primordialfollikler follikler. Ved eller kort tid etter fødselen, pattedyr eggstokkene inneholde sin levetid tilførsel av primordial follikler, fra hvilket tidspunkt og utover det er en jevn frigjøring av follikler i det voksende follikulær bassenget.

Eggstokk er spesielt mottagelig for utvikling av in vitro, med voksende follikler på en meget fysiologisk måte i kultur. Dette arbeidet beskriver kulturen i hele neonatal eggstokkene inneholder primordial follikler, og kulturen i enkelte ovariefollikler, en metode som kan støtte utviklingen av follikler fra en umoden gjennom til preovulatory stadium, hvoretter deres oocytter er i stand til å gjennomgå befruktning in vitro. Arbeidet skissert her bruker kultur systemer for å finne ut hvordan eggstokken påvirkes av eksponering for eksterne forbindelser. Vi beskriver også en co-kultur system, som gjør at etterforskningen av samspillet som oppstår mellom voksende follikler og den ikke-økende pool av primordial follikler.

Introduction

Pattedyr eggstokk er sammensatt av en kvinnes liv tilførsel av oocytter, som hver inneholdt innenfor en eggstokkfollikkelen. Folliklene blir dannet før fødsel ved hvile, opprinnelige stadium: når hårsekken bassenget er etablert, er det en kontinuerlig og gradvis bevegelse av follikler fra den opprinnelige til den voksende follikkel bassenget. Som follikler begynner å vokse, utvikle de gjennom de primære, sekundære, preantral og deretter antrum etapper, før de når preovulatory, eller Graafs, scenen. Bare ubefruktede egg fra preovulatory follikler har full utviklingskompetanse, i stand til å støtte embryoutvikling til termin, hvis befruktet.

Eggstokk har lenge vært kjent for å utvikle seg i en meget fysiologisk måte in vitro. Dette er sannsynligvis å være på grunn av hver ovarie follikkel som inneholder i seg cellene som er nødvendige for å støtte en oocytt fra umodne trinn (ved hvilket punkt den er ute av stand til å fullføre sin meiotisk divisjon) gjennom til than utviklingshemmede kompetent scenen (noe som medførte den fullt ut kan støtte gjennomføringen av meiose, befruktning og utvikling av den resulterende embryoet til termin).

Den fysiologiske natur eggstokk utvikling in vitro har ført til utstrakt bruk av eggstokkkulturteknikker. Derfor har in vitro metoder blitt brukt til å undersøke regulering av eggstokk utvikling, eggstokk patologi (for eksempel at av polycystisk ovariesyndrom, PCOS), undersøkelse av hvordan eggstokker / eggceller påvirkes av eksponering for kjemikalier, og også med den praktiske sikte på skaffe fertilizable eggceller fra primordial ovariefollikler. Til dags dato, har sistnevnte blitt oppnådd bare ved hjelp av musen eggstokkvev en, selv om kultur teknikker ved hjelp av follikler fra store pattedyr, inkludert mennesker, har kraftig forbedret de siste årene 2,3.

Vi beskriver her flere kultur metoder ved hjelp av musen eggstokkvev. Den første method bruker hele neonatale mus eggstokkene, og støtter dannelsen og tidlig utvikling av primordial follikler 4. Det andre systemet støtter veksten av individuelle, intakte ovariefollikler fra slutten preantral til preovulatory scenen; ved hjelp av denne teknikken, kan follikler dyrkes enkeltvis eller i par 5,6. Endelig beskriver vi en ko-kultur-system som kombinerer de første to teknikkene i en fremgangsmåte som tillater undersøkelse av interaksjonen mellom voksende og primordialfollikler eggstokkfollikler 7.

Kultur av individuelle intakte ovariefollikler gjør hårsekken vekst skal fastsettes fra daglige hårsekken målinger under kultur periode, mens medium analyse tillater undersøkelse av hårsekken / eggstokk hormonproduksjon. Ytterligere analyser vev kan oppnås ved en samling av follikler eller ovarievev ved slutten av kulturen, for histologiske analyser immunohistologiske / eller for etterfølgende behandling for eksempel for å oppnåmRNA eller proteiner.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer under lisens av den britiske Home Office (prosjekt lisensnummer PPL 60/1726 og 60/4026).

Merk: Hus dyr i samsvar med britiske juridiske krav i en 14 timers lys og 10 timer mørke daglengde. Utføre eksperimenter på dyr med villtype C57BL6J mus, Tau-GFP mus som har allestedsnærværende uttrykk for grønt fluorescerende protein (GFP) 8, og Thy1-YFP mus med sporadiske uttrykk for gul fluoriserende protein (YFP) i en undergruppe av nerveceller 9: både transgene linjer ble avlet på en C57BL6J bakgrunn.

1. Arbeidsforhold og klargjøring av instrumenter

  1. Utføre alle media forberedelse, vev disseksjoner, og kulturarbeid i en laminær hette for å sikre sterilitet: dette unngår kravet om tilsetting av antibiotika til media.
  2. Tillate alltid media / kultur plater / embryo retter til stabiliseringi minst 1 time, i en 37 ° C ovn (disseksjon medium / embryo retter) eller 37 ° C, 5% CO2 inkubator (kulturmedium og plater), før bruk.
  3. Suge glass pipetter i 0,1% løsning av kvegserumalbumin (BSA) for rundt en time, og deretter la det tørke. Trekk pipetter i flammen fra en gassbrenner, bøying glasset som du gjør det, for å produsere fint trukket buet glass pipetter. Etter pipetten trekkes, gjør et rent kutt med et glass cutter. Oven sterilisere ved 160 ° C i ca 45 min.
    MERK: En butikk av disse glass pipetter vil være nødvendig for å overføre eggstokker og follikler.

2. Utarbeidelse av Dissection og Kultur Media

  1. Forbered Dissection Medium.
    1. Oppløs 3 mg / ml BSA i Leibowitz L15 medium og filtersteriliser gjennom et 0,2 um pore, diameter 25 mm, filter.
  2. Neonatal Eggstokk Culture.
    1. Å forberede medium for neonatal eggstokk kultur, lage en ml medium for each eggstokk som skal dyrkes. Oppløs 3 mg / ml BSA i α-Minimal Essential Media (aMEM) og filtersteriliser gjennom en 0,2 pm porestørrelse, 13 mm diameter filter over i et sterilt rør.
    2. For å fremstille plater for neonatal eggstokk kultur, tilsett 1 ml av neonatal eggstokk dyrkningsmediet i hver brønn (en eggstokk per brønn) i en 24-brønns plate. Ved hjelp av sterile urmaker tang, legger du ett polykarbonat membran på toppen av medium i hver brønn, skinnende overflate opp. UV sterilisere membraner før bruk.
  3. Hårsekken Culture.
    1. For å fremstille medium for follikkel kultur, supplement α-Minimal Essential Media med en IU / ml rekombinant humant follikkelstimulerende hormon, 5 ug / ml askorbinsyre og 5% volum / volum serum oppnådd fra voksne hunnmus. Filter sterilisere gjennom et 0,2 um porestørrelse, 13 mm diameter filter over i et sterilt rør.
    2. Filter sterilisere silikonolje gjennom et 0,45 um porestørrelse, 25 mm diameter filter, inn i et sterilt rør.
    3. Å forberede plates ved å plassere 30 ul dråper av kulturmedium follikkel i hver brønn av en ikke-vevskultur behandlede 96-brønns mikrotiter-round-brønners plate, ved hjelp av bare den øverste raden i hver plate (for å tillate follikler å bli flyttet til nye rader hver dag i løpet dyrkningsperioden). Nøye overlappe medium med 70 ul av sterilisert silikonolje, for å forhindre fordampning medium.
  4. Hårsekken-eggstokk Co-kultur.
    1. Forberede medium for hårsekken-eggstokk co-kultur som for hårsekken kultur i trinn 2.3.1 ovenfor, gjør opp en ml medium for hver hårsekken-eggstokk co-kultur blir satt opp.
    2. For å fremstille plater, tilsett 1 ml medium i hver brønn av en 24-brønns plate. Ved hjelp av sterile urmaker tang, legger du ett Nucleopore membran på toppen av medium i hver brønn, skinnende overflate opp. UV sterilisere membraner før bruk.

3. Neonatal Eggstokk Dissection og kultur

  1. Plassere en ml disseksjon medium i hver sterile glass embryo parabolen.
    2. <li> CULL nyfødte museunger i alderen mellom postnatal dag 0 og 5, culling ved halshogging ifølge britiske hjemmekontoret forskrifter.
  2. Ta tak i huden som dekker bukveggen ved hjelp av et par av fine disseksjon pinsett og gjøre et stort snitt i huden og kroppsveggen. Trekk åpne snittet slik at hele magen blir utsatt. Blæren er vanligvis engorged på dette trinn, og kan punkteres for å gjøre lettere disseksjon.
  3. Flytt guts ut av veien ved hjelp av urmaker tang. Følg uterine horn fra blæren til nyren på hver side. Eggstokken ligger like nedenfor nyre på toppen av livmoren og vil fremstå som en sky-lignende struktur under et disseksjonsmikroskop.
  4. Ta tak i eggstokk forsiktig med urmaker tang, og bruke saks til å bryte sin tilknytning til livmoren. Overfør de to eggstokkene inn embryo retter som inneholder forvarmet disseksjon medium.
  5. Gjennomføre fin disseksjon av eggstokkene under et disseksjon mikroskop på en oppvarmet stage (37 ° C). Bruke insulin nåler for å trimme bort bursal sac og overflødig materiale, inkludert egglederen, inntil kun eggstokk gjenstår.
  6. Overfør hver eggstokk i brønnen av en kulturplate fremstilt i trinn 2.2.2 ovenfor, ved hjelp av en fint trukket buet glass-pipette, en eggstokk på toppen av hver membran (se figur 1A). Kultur i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
  7. Endre medium annenhver dag. Bruke en pipette for å utveksle 50% av mediet i hver brønn for pre-gasset friskt medium: plassere pipettespissen ved kanten av brønnen ved medium for å unngå å forstyrre membranen.
  8. Opprettholde kulturer for opptil 6 dager.
  9. Ved slutten av kulturen, frysemedium og reparere eller fryse eggstokkene etter en kort vask i PBS, etter behov.
    1. Fix eggstokkene i Bouins fiksativ i 90 min for histologisk analyse, eller i 10% nøytral bufret formalin i 90 min for immunohistological analyse. Snap fryse eggstokkene ved å plassere vev iet polypropylenrør, å plassere røret i tørr is i 5-10 min før frysing ved -70 ° C for påfølgende protein eller mRNA-ekstraksjon.

4. Follikkelstimulerende Dissection og kultur

  1. Cull 19-23 dager gamle hunnmus og isolere eggstokkene. Fukt pelsen med 70% etanol før du gjør noen snitt. Knip huden med butte endte pinsett og gjøre et stort snitt i buken med disseksjon saks, gjennomtrengende gjennom både huden og kroppen veggen.
  2. Flytt gut ut av veien ved hjelp av en finere sett disseksjon instrumenter og finn livmor. Flg livmoren inntil eggstokk, som ligger nedenfor nyrene på hver side.
  3. Forsiktig fatte eggstokken ved hjelp av et par av urmaker tang, kutte eggstokkene vedlegg til livmoren med fine disseksjon saks. Unngå å samle for mye av eggstokkene fett puten. Samle eggstokkene og overføre til et embryo retter som inneholder forvarmet disseksjon medium.
  4. Reflytte eggstokkreft bursa bruker insulin nåler for å trimme bort bursal sac og overflødig materiale, inkludert egglederen, inntil kun eggstokk gjenstår. Omtrent halvere hver eggstokk bruker insulin nåler.
  5. Overføre hver eggstokk-halv nøye i en individuell urglass inneholder 1 ml disseksjon medium. Dekke hver urglass med en glassplate for å forhindre fordampning av mediet, og for å sikre sterilitet.
  6. Butikk watch briller som inneholder eggstokk halvdeler i en 37 ° C ovn inntil nødvendig, men utfør neste disseksjon trinnet så snart som mulig. Kast vev lagret på denne måten i mer enn en time.
  7. Overføring urglass inneholdende en eggstokk halv til en 37 ° C oppvarmet objektbord i en laminær strømningshette. Grovt dissekere eggstokk i store stykker ved å bruke to insulin nåler, for å identifisere slutten av pre-antrum follikler som følger: disse vil inneholde 2-3 lag av granulosa celler og har en diameter på omkring 180-200 pm.
  8. Manuelt dissekere ut noen jegdentified follikler ved hjelp av en insulin nål og en 30 x 0,25 mm akupunkturnål som er sikret i en nål holder. Vær nøye med å fjerne det meste av den omkringliggende stroma, men unngå å skade basal lamina follikler (se figur 1B).
  9. Bruk en fint trukket buet glass pipette å nøye overføre dissekert follikler til en oppsamlings urglass inneholder forvarmet disseksjon medium. Vær nøye med å holde follikler innenfor den tynne kaliber delen av pipette for å unngå å miste follikler.
  10. Mål follikler nøyaktig ved hjelp av en kalibrert okulartrådkorset montert inn en disseksjonsmikroskop.
  11. Velg follikler for kultur bare hvis de måler 190 ± 10 mikrometer i diameter. Videre velger kun sunne, sfæriske follikler for kultur; disse vil være gjennomskinnelig, uten mørke atretic områder, og ha en intakt basal lamina, sammen med noen festet theca vev: kast eventuelle follikler som ikke passer denne beskrivelsen. Et utbytte på mellom 10-15 follikler per eggstokk er bra.
  12. Bruke et fint trukket buet glass pipette for å overføre en enkelt follikkel i brønnen av en plate fremstilt som i trinn 2.3.3 over. Plassere follicle forsiktig i bunnen av brønnen (og ikke i den øvre oljelag). Kultur i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
  13. Kultur follikler for opp til 6 dager, beveger follikler i en brønn som inneholder ferskt medium hver dag.
    1. Forberede neste rad i 96-brønns plate som i plate forberedelse i trinn 2.3.3 ovenfor. Returner platen til inkubatoren i minst en time, for å tillate likevekt. Overfør follikler i frisk brønner av medium, ved hjelp av en fint trukket glass-pipette.
    2. Hvis du på noe punkt i kulturen follikler er å stå i to dager før du flytter inn frisk medium, plasserer hver hårsekken i minimum 60 mL (i stedet for 30 pl) dråper av hårsekken dyrkingsmedium.
  14. Å samle inn data om hårsekken vekst, måle follikler daglig, ved hjelp av en eyepiece graticule montert inn en disseksjonsmikroskop. Oljelaget vil forvrenge målinger av hårsekken diameter, så regne ut kalibreringskoeffisienten for oppsettet.
  15. Ved slutten av kulturen, frysemedium og reparere eller fryse vevet for etterfølgende analyse, som i trinn 3.10 ovenfor.
  16. Hårsekken-hårsekken Co-kultur.
    1. Kultur to follikler sammen, for å undersøke samspillet mellom follikler. Kultur som ovenfor, men ved å plassere to follikler side-ved-side, i kontakt med, i en brønn.
    2. Plasser 100 ul dråper av kulturmedium follikkel i hver brønn av en ikke-vevskultur behandlede 96-brønns mikrotiter-brønn flat plate, overliggende medium med 100 ul av sterilisert silikonolje. Ikke overfør follikler inn friske brønner som i trinn 4.13 ovenfor, men i stedet bruke en fin gel tips til å endre 50% av mediet annenhver dag.
    3. For å identifisere vev opprinnelse innenfor ko-kultur, follicles ko-kulturen hver fra en forskjellig genetisk kilde, for eksempel one fra eggstokken av et villtype-mus, og den andre fra ovariet til en mus med stedsnærværende ekspresjon av GFP. Hvis du bruker GFP eller YFP vev, redusere eksponering av vev til å lyse så mye som mulig, i løpet av kultur, og gjennom fiksering / behandlingstrinn etterpå.
      MERK: Det er normalt for de to follikler til å vokse sammen til et enkelt, "to-hårsekken 'enhet (se figur 1C).

5. Follikkel-Eggstokk Co-kulturer

  1. Dissekere eggstokkene og follikler ut som i punkt 3 og 4 ovenfor.
  2. Plasser en neonatal eggstokk på toppen av en membran, i en plate fremstilt som i trinn 2.4.2 over. Forsiktig en enkelt follikkel i kontakt med en pol av den neonatale eggstokk, ved hjelp av en fint trukket buet glass-pipette. Kultur i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator for inntil 5 dager.
  3. For å skille mellom vevet opprinnelse innenfor ko-kulturen, bruk eggstokker og folliklene fra to forskjellige, såurces, eksempelvis en fra en villtype-mus, og en fra en mus med stedsnærværende ekspresjon av GFP.
  4. Erstatt 500 ul av medium hver dag som i trinn 3.8 ovenfor, men ved anvendelse av follikkel kulturmedium. Under co-kultur, hårsekken ofte blir innkapslet av eggstokken (figur 1D).
  5. Ved slutten av kulturen, frysemedium og reparere eller fryse vevet for etterfølgende analyse, som i trinn 3.10 ovenfor.

6. Fiksering, Immunocytochemistry og Imaging av Cultured Tissue

  1. Ved slutten av kulturen, vaskes vevet i PBS og overfør til 100 ul (follikkelen) eller 1 ml (ovarie) av 10% nøytral bufret formalin, og rette i 1 time på is. Bevege seg gjennom tre vasker av 1x PBS ved 4 ° C.
  2. For immunocytokjemi på follikler, transport brønner i en 96-brønns mikrotiter-round-brønners plate ved anvendelse av en fint trukket buet glass pipette til hver brønn inneholdende ulike vasker eller behandlinger.
  3. For immunocytokjemi på Ovaries (eller eggstokk-hårsekken co-kulturer), bygge inn i 4% agarosegel og § 50 mikrometer ved hjelp av en vibrotome. Flyteseksjoner i brønnene til en 24-brønners plate for å anvende vasker eller behandlinger, fjerning av med en pipette.
  4. For bildebehandling: overføre agarose seksjoner til flate glassplater og montere med monterings medium; eller overføre follikler (eller hårsekken-follicle komplekser) til hulrom glassplater og montere med ikke-herdende monteringsmedium. Bilde prøver ved hjelp av en konfokal mikroskop.

Representative Results

Figur 1 viser bilder av eggstokkene og follikler ved starten av, og under, prosedyrer kultur.

Figur 2 viser representative resultatene av neonatal eggstokkene (her, eggstokkene fra nyfødte valper) utsatt for reproduktive miljøgifter under kultur. Neonatale eggstokkene ble dyrket i 6 dager, og utsatt for et kjemoterapi narkotika, enten cisplatin eller doxorubicin, på dag 2 av kultur. Ved slutten av kulturen, ble eggstokkene fast, bearbeidet for histologi og eggstokker så undersøkt for å bestemme antallet av sunne og usunne eggstokkfollikler 4. Alternativt kan en mer rask vurdering av tidlige voksende follikler fås fra kulturen i eggstokkene fragmenter, ved hjelp av eggstokkene fra en mus som uttrykker en eggcelle spesifikke fluoriserende fargestoff 10.

I løpet av kulturen i enkelte follikler, kan hårsekken vekst lett konstatert av daglige målinger i løpet av blindture perioden. Figur 3 viser representative resultater av vekst av follikler dyrket i nærvær eller fravær av gonadotropin hormoner follikkelstimulerende hormon (FSH) og luteiniserende hormon (LH) 5.

Follicle-follikkel eller follicle-eggstokk ko-kultur kan anvendes for å undersøke interaksjonen mellom follikler. Avhengig av vev og behandling, kan bildene bli oppnådd ved å bruke lyse-feltet, fluorescens eller konfokale mikroskoper. Figur 4 viser representative resultatene av bilder fra slike co-kulturer, undersøke ulike celletyper som er involvert i hårsekken-hårsekken kommunikasjon, inkludert endothelial og nerveceller 7.

Figur 1
Figur 1: (A) Mikroskopbilde av en neonatal eggstokk hentet fra en mus på den dagen du ble født, plassert på en polykarbonat membran. (B) Mikroskopbilde av fersk dissekert sunn eggstokkfollikkelen, med det meste av det omkringliggende stromal vev dissekert unna. (C) Mikrofotografier av co-kultur av to follikler enn de tre første dagene av kultur, som viser den nære kontakten som utvikler seg mellom de to follikler som kulturen provenyet (KI: første dag av kultur; Cii: andre dag av kultur; cIII : tredje dag med kultur). Gjengitt fra Spears et al. 11 (D) Mikroskopbilde av co-kultivert preantral hårsekken og neonatal eggstokk etter to dager med kultur. Bildet viser hårsekken blir innkapslet av eggstokken. Pilen viser preantral hårsekken. Bilde fra Dr Federica Lopes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

gur 2 "src =" / files / ftp_upload / 52458 / 52458fig2.jpg "/>
Figur 2: Effekt av kjemoterapi narkotika cisplatin og doxorubicin på nyfødte dyrkede eggstokkene Cisplatin og doksorubicin både føre til tap av hårsekken helse og en reduksjon i hårsekken tall.. (A) Cisplatin; (B) Doksorubicin: (i) Prosent av usunn follikler (klar); og (ii) totalt antall follikler (skyggelagt) i hver eggstokk. Barer betegne bety + sem; n = 5 for alle grupper, stjerner angir signifikante forskjeller i forhold til kontroll (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Gjengitt fra Morgan et al. 4

Figur 3
Figur 3:. Vekst priser av follikler eksponert for ulike gonadotropin miljøer Verdier er gjennomsnitt ± SEM (n ≥16 for hver gruppe). Pil indikerer starten på Antral formasjonen i alle gonadotropin grupper. Gjengitt fra Murray et al. 5

Figur 4
Figur 4: Bilder fra hårsekken-hårsekken og eggstokk-follicle co-kulturer, viser hårsekken-follicle interaksjoner (A) Confocal mikrograf av et grønt fluorescerende protein (GFP) hårsekken og en villtype (WT) hårsekken etter co-kultur (. GFP uttrykk her vist i hvitt), med prosesser fra GFP hårsekken vist som strekker seg over WT hårsekken. (B) Tverrsnitt gjennom en GFP / WT follicle-komplekset etter ko-kulturen, hvilket viser at GFP prosesser (grønt) fra den tilstøtende follikkelen ligger ved siden av den basale lamina på WT follikkel. (C) Neonatal WT eggstokk etter kultur med en pre-antral GFP-uttrykke hårsekken, som viser at GFP celler og cellulære prosesser (grønn) har migrertgjennom eggstokk interstitum av nyfødt eggstokk. (D) GFP / WT follicle-komplekset inneholdende endotelceller, som er vist ved ekspresjon av endotelial cellemarkør CD31 (rød). (E) GFP / WT follicle-komplekset inneholdende neuronale celler, vist ved ekspresjon av neuronal markør beta-tubulin III (se her som rødt, eller som gult hvis dobbeltmerket med GFP, grønn). (F) YFP / WT follicle-komplekset, hvor YFP refererer til follikkel en Thy1-YFP mus som har svis ekspresjon av gule fluorescerende protein (YFP: gul) i en undergruppe av neuronale celler 9, som viser at neuroner strekker seg fra YFP follikkelen. Barer 50 um (A, B, D), 100 nm (C, E, F), 100 nm (innfelt i A), 10 um (innfelt i C), 15 um (innfelt i D). Gjengitt fra Campbell et al. 7 Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Discussion

Vi beskriver her ulike dyrkingssystemer som kan benyttes for å støtte utviklingen av mus ovariefollikler in vitro, bruker hele neonatal eggstokkene som kun inneholder de tidligste hårsekken etapper, individuelle preantral ovariefollikler og også co-kulturer av de to vev.

Culture of neonatal mus eggstokkene støtter tidlig eggstokk utvikling, spesielt hårsekken vekst initiering opp til den sekundære hårsekken scenen. En rekke alderen neonatale mus kan brukes til disse kulturene, avhengig av utviklingsstadier av interesse. Hvis eggstokkene er hentet fra nyfødte mus, vil hårsekken formasjon være i gang, men ikke ennå fullført: kultur vil hvertfall delvis fortsatt hårsekken dannelsen fulgt av hårsekken vekst. Alternativt kan (ved hvilket tidspunkt follicle formasjon allerede er fullført) bruk av ovarier fra mus rundt fire-til-fem-dagers alder fører til kulturen i et større antall opprinnelige og voksende Follicles 12. Fordelaktige sider ved den bestemte teknikk som er beskrevet her inkluderer bruk av flytende polykarbonat-membraner, noe som tillater større oksygenering av vevet, og kulturen i et meget basisk medium som består av bare aMEM og BSA, unngår bruk av udefinerte additiver slik som serum. Kultur av hele ovarier synes ikke å støtte utvikling utover den sekundære follicle trinn, med påfølgende utvikling som krever en endring i teknikken, slik som disseksjon av follikkel-granulosa-cellekomplekser fra dyrkede neonatal eggstokk 1.

Senere stadier av follikkelutvikling kan utvikles in vitro ved å dissekere ut individuelle, intakte sen pre-antrum follikler, noe som kan dyrkes til preovulatory stadium i kultur samtidig opprettholde sin tredimensjonale struktur. Bruken av intakte follikler for denne dyrkningsteknikk opprettholder forholdet mellom de forskjellige komponenter follikulære som oppstår in vivo. This kultursystemet kan bli anvendt for å oppnå oocytter som kan støtte gjødsling og påfølgende embryoutvikling.

Fertilizable oocytter kan også fås fra mus neonatale eggstokkene ved hjelp av en startkultur protokoll mye som er beskrevet her, etterfulgt av et andre trinn hvorunder oocytt-granulosa-cellekomplekser er dyrket in vitro 1. Andre systemer som brukes i dag er ganske ofte kultur av follikler eller eggstokk-vev som er blitt innkapslet i et materiale slik som alginat hydrogel, for å gi støtte (se, for eksempel, Tagler et al. 13). Mye av fokus for metodeutvikling nå er å forbedre kultur teknikker for eggstokkene og follikler av større pattedyr, med den langsiktige mål om å skaffe fertilisable ubefruktede egg fra primordial follikler fra en rekke arter, inkludert mennesker.

Til enhver tid, pattedyr eggstokkene inneholde follikler på en rekke utviklingsstadier, med interactions mellom follikler som påvirker deres regulering. Dette aspektet av ovarial funksjon er dårlig forstått og vanskelig å undersøke in vivo. Den siste metoden er beskrevet her bruker co-kultur-systemer for å støtte utviklingen av ulike stadier av follikler in vitro. Om nødvendig, kan en eller begge vevene kan være forhåndsbehandlet in vivo eller in vitro før ko-kultur. Co-kultur systemer som dette gir en ideell måte å undersøke hårsekken-follicle interaksjoner, for eksempel hvordan vokser, antrum follikler påvirke primordial hårsekken basseng, til aspekter av eggstokkreft biologi som har vist seg vanskelig undersøke før nå.

Hele ovarie dyrkningsteknikker er ganske enkel, men forsiktig disseksjon er nødvendig for å unngå uønsket skade på vev. Disseksjon av individuelle follikler er en spesialisert teknikk, som krever gjentatt praksis før follikler til rett scene kan bli dissekert ut fra eggstokken intakt og uskadet. Det er kritiskå dissekere ut enkelt follikler nøye, eller skader pådratt i disseksjon protokollen kan resultere i hårsekken død under den påfølgende kultur periode. Der folliklene blir plassert direkte inn i brønnen av mikrotiter-plater, er det viktig å bruke bare ikke-vevskultur behandlede plast, for å redusere utplating ned av intraspinal celler på plast: hvis vevskultur behandlede -plast benyttes, vil de follikler feste til bunnen av brønnen og brudd som de vokser. For alle ko-kulturarbeid, må vev plasseres direkte i kontakt med hverandre.

Mediet beskrevet ovenfor for bruk i hårsekken dyrkningsteknikk omfatter tilsetning av museserum. Det er mulig å bytte ut museserum med føtalt bovint serum, men bare sporadiske grupper av slike sera vil gi full støtte follikkelutvikling til preovulatory stadium, med batch-testing er nødvendig for å identifisere egnede kilder. Batch-testing av FSH er også lurt, som International Units der FSH vurderes korrelerer bare grovt til hårsekken vekst in vitro. Hvis hårsekken ryker rutinemessig under kultur periode, bør du vurdere å erstatte lager askorbinsyre med en ny ladning.

De teknikker som ikke krever særlig spesialisert utstyr annet enn dissekere mikroskoper og inkubatorer vev kultur, selv om anvendelse av en laminær strømningshette og god steril teknikk tillater eggstokkfollikler å bli dyrket i fravær av antibiotika, slik som i fremgangsmåtene beskrevet her. Dette kan være nyttig, for å unngå enhver potensiell skadelig virkning av antibiotika på oocytter, særlig hvis de skal bli befruktet etter kultur. Hvor det ikke er mulig å arbeide i et sterilt miljø, er det tilrådelig å legge antibiotika til disseksjon og kultur media.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibowitz L15 Invitrogen 11415049
αMEM Invitrogen 22571020 Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L)
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A9418 For dissection medium
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3311 For culture medium
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A2153 For coating glass pipettes
Mouse serum - - Collected from cardiac puncture
FSH Merck Serono Gonal F Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C.
Ascorbic acid Sigma Aldrich A4034 Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C.
Silicon oil VWR 630064V Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS
Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) Greiner 16532K Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium.
Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) Iwaki 3032-013 Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium
Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) Iwaki 2053-025 Cellulose acetate filter for filtering oil.
Sterile tubes Greiner 187261
24-well plate Greiner 662160
96-well round bottom plate Iwaki 3875-096 Use only non-tissue culture treated plates
96-well flat bottomed well Iwaki 3860-096 Use only non-tissue culture treated plates
Whatman nucleopore membranes Camlab WN/110414 Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size
Insulin needles BD medical supplies 037-7606 0.33 mm (29 G) + 1 ml
Glass embryo dishes VWR 720-0579 Sterilize, then warm before use.
Glass pipettes Fisher Scientific 10209381 BSA coated before use.
Gel tips AlphaLabs LW1103
Acupuncture needles Acumedic LTD 30 mm x 0.25 Type C
Bouin’s fixative Sigma Aldrich HT10132-1L
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT5014-120ml
1.5 ml polypropylene tubes Greiner BioOne 616201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).
  2. Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).
  3. McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles. Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).
  4. Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin. PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).
  5. Murray, A. A., et al. Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids. Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).
  6. Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
  7. Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles. Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).
  8. Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein. Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).
  9. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  10. Maiani, E., et al. Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib. Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).
  11. Spears, N., Bruin, dr, Gosden, J. P., G, R. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
  12. Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).
  13. Tagler, D., et al. Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).

Tags

Cellular Biology reproduksjonsbiologi eggstokk kultur teknikk hårsekken eggcelle theca celle immunocytochemistry
Kultur og Co-Culture of Mouse Eggstokkene og ovariefollikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, S., Campbell, L., Allison,… More

Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. J. Vis. Exp. (97), e52458, doi:10.3791/52458 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter